苯并异色烷醌类家族抗生素生物合成中的新型调控蛋白的作用机制

摘要

苯并异色烷醌(benzoisochromanequinones，BIQs)类抗生素属于芳香聚酮类抗生素，由链霉菌次生代谢产生，分别具有杀菌、抗肿瘤、杀虫等多种生物学活性。这类家族包括美达霉素（具有抗肿瘤活性）和研究较深入的放线紫红素（抗菌活性）等，它们母核结构类似，都有两个芳香环和一个手性吡喃环形成的并联三环结构，推断它们的母核的生物合成途径相似。美达霉素与放线紫红素的手性吡喃环相同，都是(3S、15R)构型。根据同源性推测:美达霉素基因簇中的med-ORF29可能编码烯酰还原酶，参与美达霉素手性中心的形成。基因簇中还存在一个小调控基因med-ORF10，与放线紫红素基因簇中的actⅥ-ORFA高度同源;已经证明actⅥ-ORFA编码产物是正调控因子，调控放线紫红素生物合成。
　　本项目对BIQ抗生素基因簇中涉及后期修饰和调控的基因展开相关研究:
　　1)天蓝色链霉菌野生菌和actⅥ-ORFA缺失突变菌株蛋白组学研究
　　大量液体发酵野生型天蓝色链霉菌和actⅥ-ORFA缺失突变菌株，提取全蛋白，做蛋白质双向电泳实验。蛋白质胶图分析显示actⅥ-ORFA缺失后表达量上调蛋白点大约167个，表达量下调蛋白点大约130个，暗示这个actⅥ-ORFA可能是个多效性调节因子。
　　然后我们选取了30个感兴趣的蛋白点做质谱分析。质谱结果显示:30个蛋白表达差异点中，仅找到两个蛋白点(ActⅥ-ORFA与ActⅥ-ORF4)，是放线紫红素合成基因簇编码，其它鉴定的差异点蛋白都是基因簇外的基因编码。但曾预期转录水平上放线紫红素基因簇中会多个基因的表达受到actⅥ-ORFA的调控。从蛋白表达量来看，actⅥ-ORFA编码的蛋白在actⅥ-ORFA缺失菌中不表达（因已经敲出）;actⅥ-ORF4编码的蛋白在actⅥ-ORFA缺失菌中表达量下调2.6倍。
　　2)放线紫红素基因簇中调控基因actⅥ-ORFA的可能的靶基因转录水平的RT-PCR分析
　　由于actⅥ-ORF4与预测的靶基因actⅥ-ORF1属于同一转录单元，我们同时对actⅥ-ORF4及actⅥ-ORF1进行荧光定量PCR分析，验证它们在转录水平上的变化。通过大量培养野生菌与actⅥ-ORFA缺失菌，提取总RNA进行反转录，进行荧光定量PCR。结果显示actⅥ-ORF4在actⅥ-ORFA缺失菌中转录水平下调75倍，actⅥ-ORF在actⅥ-ORFA缺失菌Ⅵ-A/pIJ8600中转录水平下调56倍。
　　结合蛋白组学和荧光定量PCR的结果表明，actⅥ-ORF4和actⅥ-ORF1极大可能为actⅥ-ORFA的调控靶基因。至于以何种形式进行调控以及是否还有其他靶基因存在，还需要进一步的研究探索。
　　3)美达霉素基因簇中med-ORF29功能研究:
　　首先构建用于med-ORF29基因敲除的质粒pHSL143，通过接合转移的方式将质粒pHSL143导入野生型链霉菌中，然后筛选双交换的缺失突变菌株，然而多次试验均未得到得到正确的med-ORF29敲除突变菌株，而一株突变菌株(LL-2)总能得到，怀疑可能基因组上存在其它同源酶（或另一拷贝的med-ORF29）被优先敲出。
　　将突变菌株（LL-2）液体发酵后，利用HPLC分析发酵液上清中美达霉素的含量，发现美达霉素含量基本不变，但是有其他产物含量上升。
　　然后进行了med-ORF29超表达实验:扩增med-ORF29基因，克隆到了链霉菌的整合型质粒pIJ8600上，成功构建了用于med-ORF29超量表达的质粒pHSL144。通过接合转移的方式把质粒pHSL144导入野生链霉菌中，得到了med-ORF29超量表达菌株AM-7161/pHSL144（发酵和目标化合物产量检测正在进行中）。
　　4)美达霉素基因簇中Med-ORF29与med-ORF10关系研究:
　　前期已经构建Med-ORF29原核表达质粒，我们在大肠杆菌中对Med-ORF29进行诱导表达并纯化，将纯化得到的Med-ORF29蛋白注射兔子获得多克隆抗体。制备得到的抗体经特异性检测后，再用于检测Med-ORF29在野生链霉菌中的表达情况。研究发现:相对于在野生菌种，在调控基因med-ORF10缺失株中，Med-ORF29表达量下调，而在med-ORF10超量表达菌株中，Med-ORF29表达量上调，说明Med-ORF29的表达可能直接或间接受控于med-ORF10。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 链霉菌

1．2 链霉菌与抗生素

1．3 链霉菌基因组的特点

1．4 BIQ同族抗生素

1．5 抗生素合成相关的分子调控

1．6 放线紫红素中的调控基因actⅥ-ORFA

1．7 BIQ手性结构与相关基因

1．8 本研究的目的及意义

第二章 材料与方法

2．1 菌株

2．2 质粒

2．3 培养基

2．3．1 大肠杆菌培养基

2．3．2 链霉菌培养基

2．4 试剂和溶液

2．4．1 大肠杆菌质粒DNA小量提取试剂【Sambrook J et al，2001】溶液I

2．4．2 链霉菌DNA的提取

2．4．3 Tricine-SDS-PAGE试剂【IlsaL，1987】

2．4．4 缓冲液【Kieser T．et al．，1999】

2．4．5 其他试剂

2．4．6 酶和生化试剂

2．4．7 抗生素

2．4．8 实验中所用的引物

2．5 实验方法

2．5．1 碱裂解法提取大肠杆菌质粒【萨姆布鲁克J，1996】

2．5．2 大肠杆的菌感受态细胞制备及转化【萨姆布鲁克 J，1996】

2．5．3 大肠杆菌菌种的保存

2．5．4 DNA体外操作

2．5．5 链霉菌的培养及常规操作

2．5．6 Tricine-SDS-PAGE

2．5．7 Western blot【Sambrook J．et al．，2001】

2．5．8 非变性蛋白纯化(His标签)

2．5．9 切胶制备抗体

2．5．10 链霉菌发酵产物提取

2．5．11 HPLC分析条件【Ichinose K．et al．，2003】

2．5．12 总RNA的反转录

2．5．13 实时荧光定量PCR

2．5．14 蛋白质双向电泳

第三章 调控基因actⅥ—ORFA缺失突变菌的蛋白组学研究和靶基因RT-PCR分析

3．1 野生型菌株J1501／PIJ8600及actⅥ-ORFA缺失型菌株Ⅵ-A／pIJ8600蛋白组学实验方案

3．1．1 菌株的鉴定

3．1．2 菌株大量培养

3．1．3 蛋白质双向电泳

3．1．4 质谱分析

3．2 RT-PCR验证

3．2．1 RNA的提取

3．2．2 基因组DNA的去除及RNA的反转录

3．2．3 RT-PCR引物设计

3．2．4 合成的cDNA效果检测

3．2．5 荧光定量PCR扩增hrdB、actⅥ-ORF1及actⅥ-ORF4

3．2．6 基因actⅥ-ORF1及actⅥ-ORF4相对表达量

3．3 本章讨论

3．3．1 actⅥ-ORFA敲出菌蛋白组学分析

3．3．2 actⅥ-ORFA与放线紫红素合成基因

第四章 美达霉素生物合成过程中烯酰还原酶基因med-ORF29的功能初探

4．1 med-ORF29的敲除

4．1．1 野生型菌株med-ORF29敲除与互补实验方案

4．1．2 自杀质粒构建示意图

4．1．3 自杀质粒的构建

4．1．4 自杀质粒的构建与验证

4．1．5 接合转移进行同源重组

4．1．6 med-ORF29敲除菌株筛选

4．1．5 筛选所得菌株液相色谱分析

4．2 Med-29超量表达

4．2．1 实验流程

4．2．2 超量表达菌株的构建

4．2．3 超量表达菌株AM-7161／PHSL144分子水平验证

4．3 Med-ORF29蛋白纯化及抗体的制备

4．3．1 Med-ORF29蛋白诱导表达条件确定及纯化条件探索

4．3．2 Med-ORF29抗体制备

4．3．3 利用制备多克隆抗体来检测野生型链霉菌中Med-ORF29的表达情况

4．4 本章讨论

总结与展望

参考文献

硕士期间发表论文

致谢