链霉菌抗生素生物合成基因簇中调控基因作用机制的初步研究

摘要

模式菌株天蓝色链霉菌产生的放线紫红素是具有抗菌活性的芳香聚酮类抗生素。其生物合成基因簇中的actVI-ORFA可能与放线紫红素生物合成的调控有关。另一株链霉菌AM7161积累的美达霉素生物合成基因簇中也有一个同源基因med-ORF10功能与之相似，参与美达霉素的生物合成调控。 本研究以调控基因actVI-ORFA和med-ORF10为研究对象，利用分子生物学和分析化学等多种手段，对actVI-ORFA和med-ORF10的调控机制展开初步研究，具体内容如下: (1)ActVI-ORFA蛋白的抗体制备及胞内表达检测 为了研究actVI-ORFA在野生菌中的表达情况以及可能的调控机制，首先利用pET载体建立了actVI-ORFA的原核表达系统，在优化诱导表达条件的基础上获得了可溶性目的蛋白，制备了相应的多抗血清;然后利用多抗血清对放线紫红素产生菌中的目的基因的表达情况进行了检测，表明它在产生菌的稳定期大量表达，同时伴随放线紫红素的大量积累;在该基因缺失突变菌中，该蛋白表达缺失，放线紫红素产量急剧降低。这些结果从翻译水平上说明基因actVI-ORFA参与次生代谢，与放线紫红素生物合成有一定相关性，但调控机制有待进一步揭示。 (2)ActVI-ORFA蛋白的调控机制初步研究 前期研究发现ActVI-ORFA在放线紫红素生物合成中起调控作用，从转录水平上调控同一基因簇几个基因的转录，且主要调控靶点是actVI-ORF1（编码立体专一性酮基还原酶，控制C3位置的手性结构的形成），但调控机制一直未有研究。 我们首先通过凝胶迁移实验(EMSA)检测ActVI-ORFA蛋白是否与actVI-ORF1的启动子区域直接结合发挥其调控作用:将靶基因actVI-ORF1的启动子片段(PactVI-ORF1)进行生物素标记，纯化透析的ActVI-ORFA蛋白与标记了的PactVI-ORF1共孵育，反应后体系进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜经X光曝光显影，在目前条件下ActVI-ORFA蛋白与PactVI-ORF1无明显结合现象，推测二者可能无直接结合作用，或二者即便有直接结合作用，但结合的条件较为苛刻。 我们利用Pull down实验探究可能与之作用的蛋白:鉴于目的蛋白序列内部没有明显的DNA结合结构域，EMSA实验也未发现与靶DNA有结合能力，初步判断ActVI-ORFA蛋白可能不是通过与靶启动子结合行使调控作用，很可能是与天蓝色链霉菌里的某种蛋白直接结合来调控放线紫红素的合成。接下来，我们将经纯化、透析、浓缩后的ActVI-ORFA蛋白加入到actVI-ORFA缺失菌株VI-A/8600全蛋白中孵育，收集洗脱液，SDS-PAGE电泳检测，发现目的蛋白发生特异位点剪切，蛋白变小。进一步进行肽质谱分析，发现ActVI-ORFA的N端发生若干个氨基酸的缺失。这种蛋白酶活性有可能来自反应系统中其他蛋白，不排除是来自于目的蛋白的自我切割。 (3)Med-ORF10蛋白的抗体特异性改进 前期实验利用Med-ORF10蛋白制备的多克隆抗体（鼠、兔两种来源）检测链霉菌中目的蛋白表达，发现检测出的目的蛋白分子量加倍。本实验对med-ORF10基因进行了体外的串联体大片段克隆，原核表达、纯化，分别注射了新西兰大白兔，制备Med-ORF10二串联体蛋白和三串联体蛋白的多克隆抗体。然而当使用制备的两种抗体检测链霉菌体内目的基因的表达情况时，在野生菌链霉菌AM7161、AM7161/pHSL98（过量表达Med-ORF10蛋白的菌株）和CH999/PIK340（全基因簇异源表达菌株）均无法检测到目标大小16KDa的阳性条带，在其约两倍大小32KDa处检测到明显条带，初步推测目的蛋白的翻译后修饰问题:在链霉菌中可能存在蛋白产物的某种类型的修饰，导致分子量变成其二倍大小。

目录

声明

摘要

第一章前言

1．1链霉菌和抗生素

1．1．1链霉菌简介

1．1．2链霉菌源抗生素

1．2抗生素生物合成的分子调控

1．3有关放线紫红素和美达霉素

1．4本研究的目的和意义

2．1菌株

2．2质粒

2．3培养基

2．3．1链霉菌培养基

2．3．2大肠杆菌培养基

2．4溶液和试剂

2．4．1大肠杆菌质粒DNA小量提取试剂

2．4．2 Tncine-SDS-PAGE试剂

2．4．3非变性聚丙烯酰胺凝胶试剂

2．4．4 Western blot试剂

2．4．5非变性蛋白纯化试剂(His标签)

2．4．6蛋白透析液(10X)

2．4．8抗生素

2．4．9缓冲液

2．4．10其他试剂、酶和试剂盒

2．5实验方法

2．5．1大肠杆菌质粒DNA小量提取(碱性裂解法)

2．5．2大肠杆菌感受态细胞制备(CaCl2法)及转化

2．5．3 DNA体外操作

2．5．4大肠杆菌菌种的保存

2．5．5链霉菌的液体培养

2．5．6链霉菌的固体培养

2．5．7链霉菌孢子的收集

2．5．8 Tricine-SDS-PAGE (检测小分子量蛋白)

2．5．10非变性蛋白纯化(带His标签)

2．5．11多克隆抗体的制备

2．5．12 Pull down

2．5．13肽质谱分析

2．5．14 EMSA

第三章ActⅥ-ORFA蛋白的抗体制备及胞内表达检测

3．2 ActⅥ-ORFA蛋白的原核表达和纯化

3．3 ActⅥ-ORFA蛋白的抗体制备和特异性检测

3．4 ActⅥ-ORFA蛋白体内表达检测

3．5本章讨论

第四章ActⅥ-ORFA蛋白的调控机制初步研究

4．1靶基因启动子的扩增

4．3 ActⅥ-ORFA蛋白与PactⅥ-ORF1结合反应

4．4 Pull-down实验

4．5本章讨论

第五章Med-ORF10蛋白的抗体特异性改进

5．2 Med-ORF10蛋白串连体的表达和纯化

5．3 Med-ORF10蛋白串连体的多克隆抗体的制备

5．4检测野生菌链霉菌和超表达菌链霉菌内Med-ORF10的表达情况

5．5本章讨论

总结与展望

参考文献

硕士期间发表的论文

附录

致谢