2型糖尿病GWAS关联SNP对miRNA-mRNA互作的影响分析

摘要

2型糖尿病(type2 diabetes，T2D)是严重危害人类健康的常见复杂疾病，受遗传与环境的共同影响，其遗传力大约为80％。全基因组关联研究(GWAS)是基因组时代寻找复杂疾病易感基因的主要方法。到目前为止，53个T2D GWAS研究共报道易感基因334个，单核苷酸多态性(SNP)324个(p＜1×10-5)。T2D遗传学研究未来的挑战就是理解这些基因和SNP如何影响T2D的易感性。SNP影响疾病易感性的可能机制之一就是通过影响miRNA-mRNA的相互作用调控基因的表达。本研究的目的就是分析T2D GWAS关联SNP及其连锁SNP对miRNA-mRNA互作的影响，鉴定影响miRNA-mRNA互作的SNP，解析T2D关联SNP的功能，揭示SNP影响T2D易感性的分子病理机制。
　　首先，从NCBI和HuGE Navigator数据库检索T2D相关的GWAS文章，汇总与T2D关联的基因和SNP，通过Hapmap数据库收集与GWAS关联SNP紧密连锁的SNP。随后，利用Target Scan、miRWalk等6个软件分析miRNA-gene的相互作用，利用miRNASNP、mrSNP、MirSNP和SNPinfo sevr等软件分析SNP对miRNA-mRNA互作的影响。最后，对阳性预测结果进行实验验证，构建SNP与miRNA相应重组载体，通过双荧光素酶报告基因系统检测分析SNP对miRNA-mRNA互作的影响。
　　我们预测了靶向调控T2D GWAS关联hub基因的miRNA，从1675个T2D关联SNP中鉴定了5个GWAS关联SNP和25个连锁SNP潜在影响miRNA-mRNA互作。我们选择rs6426514、rs11558471、rs2466293和rs113040697作为实验验证的目标，检测SNP等位基因转录活性差异和对miRNA-mRNA互作的影响。实验结果显示，四个SNPs对miRNAs结合的影响差异不显著，预测结果均为假阳性。但rs11558471的等位基因转录丰度存在明显差异，可能存在其他的调控机制。我们的结果说明了计算分析的局限性和把计算分析与实验研究相结合的重要性。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 2型糖尿病的遗传学

1．1．1 2型糖尿病概述

1．1．2 2型糖尿病的遗传学研究

1．1．3 T2D GWAS关联SNP

1．2 miRNA

1．2．1 miRNA概述

1．2．2 miRNA靶基因的预测方法

1．2．3 SNP影响miRNA-mRNA互作的计算分析

1．3 SLC30A8基因

1．3．1 SLC30A8基因的结构和功能

1．3．2 SLC30A8基因及其SNP与2型糖尿病

1．4 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 T2D GWAS关联SNP对miRNA-mRNA互作影响的计算分析

2．1．1 T2D GWAS关联SNP及其连锁SNP

2．1．2 计算分析方法

2．2 预测结果的实验验证

2．2．1 实验设备

2．2．2 实验试剂

2．2．3 DH5α大肠杆菌感受态细胞的制备

2．2．4 3'UTR重组载体的构建

2．2．5 miRNA表达载体的构建

2．2．6 细胞转染

2．2．7 双荧光素酶报告基因检测

3 结果与分析

3．1 T2D GWAS关联SNP及其连锁SNP

3．2 T2D GWAS关联SNP及其连锁SNP对miRNA-mRNA互作的影响

3．3 T2D GWAS关联基因与miRNA的相互作用

3．3．1 T2D GWAS关联基因的蛋白质互作网络图

3．3．2 T2D GWAS关联hub基因与miRNA的相互作用

3．4 实验验证SNP对miRNA结合的影响

3．4．1 重组载体构建结果

3．4．2 调控SLC30A8的天然miRNA

3．4．3 RHO rs6426514 SNP等位基因转录丰度差异

3．4．4 SLC30A8 rs11558471与hsa-miR-1205／3074／3667

3．4．6 SLC30A8 rs113040697与hsa-miR-134／758／3122／3193

4 讨论

4．1 SNP对miRNA-mRNA互作的影响

4．2 调控T2D GWAS关联基因的miRNA

5 结论与展望

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

附录