戈登氏菌属Dordonia sp.peh基因簇克隆表达及转运蛋白功能分析

摘要

邻苯二甲酸二辛酯(Di-n-octyl ortho-phthalate，DOP)是邻苯二甲酸的酯化衍生物，属于邻苯二甲酸酯类（PAEs，又名酞酸酯）。应用于涂料、食品包装材料、润滑剂、药品、化肥、化妆品、农药、医疗器械、儿童玩具等领域，是一种广泛利用的增塑剂。DOP具有生物富集作用，对人体造成神经毒性、生殖毒性和多器官癌变等病变，严重威胁到人的生存与发展，已经引起国内外广泛关注。美国环保局(EPA)已经将其列入优先控制有毒污染物，DEP、DMP与DOP也被中国政府确定为优先控制污染物。毒理学实验表明DOP对人体具有致突变性、致癌性、致畸形和拟/抗甲状腺激素活性、拟/抗雌激素活性等内分泌干扰特性;同时是一种环境激素类化合物。环境中的DOP主要通过生物降解和光解这两种途径，光解速度较慢、周期较长，因此生物降解是DOP降解的最主要方式。目前对DOP微生物降解的研究包括降解菌的筛选、鉴定、降解途径及降解特性分析，对降解途径中蛋白的主要功能的研究较少。
　　本文以戈登氏菌属Gordonia sp.HS-NH1为材料，克隆表达了邻苯二甲酸酯降解过程中的关键酶邻苯二甲酸酯酶(PehA)和邻苯二甲酸单酯酶(PehB)，并研究了其功能和特性。结合基因敲降技术构建了缺失转运蛋白ABC/MFS基因的敲除突变株，并对突变株的代谢途径与降解特性进行了研究。主要结果如下:
　　通过基因组扫描得知戈登氏菌HS-NH1的pehA基因全长594bp，编码197个氨基酸，经过blast比对发现其与红球菌属Rhodococcus sp.YK2的pehA序列(GI:21388688)同源性较高，达到98％;pehB基因全长852bp，编码283个氨基酸，与戈登氏菌属Gordonia sp.P8219的pehB序列(GI:85677422)具有99％的相似性。采用基因克隆技术，通过设计引物、PCR扩增，成功构建了重组表达质粒pET-pehA和pET-pehB，并在E.coliBL21得到高效表达。SDS-PAGE电泳分析，重组酶PehA和PehB的分子量分别为27KDa和30Kda。酶活性检测表明重组酶PehA和PehB对长链的PAE具有良好的水解活性。为进一步深入研究该酶的功能与结构奠定了一定的基础。
　　利用同源重组的方法敲除了戈登氏菌(Gordonia sp.)HS-NH1的ABC和MFS转运蛋白基因，成功构建了ABC转运蛋白敲除突变菌株和MFS转运蛋白敲除突变菌株，分别命名为HS-NH1-△MFS和HS-NH1-△ABC。对突变菌株的代谢途径、基因功能与降解特性进行了研究。研究结果表明:戈登氏菌(Gordonia sp.)HS-NH1降解DOP的最适生长条件为30℃、pH7.0，该菌能在120小时内DOP降解率为80％。突变株HS-NH1-△MFS在同等条件下(温度为30℃、pH7.0)对DOP的降解效率显著下降，降解效率仅有20％;而突变菌株HS-NH1-△ABC不能以DOP为唯一碳源的培养机中生长。底物广谱性分析表明，戈登氏菌(Gordonia sp.HS-NH1)能高效利用常见的PAE（如DOP、DEHP），及其代谢物(PCA)。突变菌株HS-NH1-△MFS能够利用长链的邻苯二甲酸酯类，如DOP、DEHP等，但利用效率较低;不能利用短链的PAE，如邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)以及邻苯二甲酸(PA)与原儿茶酸PCA等;而HS-NH1-△ABC不能在PAE及其代谢产物作作为唯一碳源的培养基中生长。说明MFS与ABC转运蛋白都能转运邻苯二甲酸，将邻苯二甲酸运输到细胞内进行进一步降解，ABC转运蛋白作为PA主要的运输蛋白，MFS转运蛋白作为辅助的运输蛋白。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 引言

1．2 DOP的结构及理化性质表

1．2．1 DOP的结构

1．2．2 DOP的理化性质

1．3 DOP在环境中的分布

1．3．1 DOP在水体中的分布

1．3．2 DOP在土壤中的分布

1．3．3 DOP在大气中的分布

1．3．4 DOP在生物体中的富集

1．4 DOP的毒性作用

1．4．1 DOP的致突变作用

1．4．2 DOP对肝脏、肾脏和神经系统的损伤

1．4．3 DOP对生殖发育和细胞的毒性

1．5 DOP在自然环境中的降解

1．5．1 DOP的水解作用

1．5．2 DOP的光解作用

1．5．3 DOP的真菌降解

1．5．4 DOP的细菌降解

1．6 DOP降解的相关基因

1．6．1 pht基因簇

1．6．2 pca基因簇

1．6．3 peh基因簇

1．6．4 ABC与MFS转运蛋白

1．7 本研究的目的与意义

第二章 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 主要试剂

2．1．2 主要器材

2．1．3 菌种与质粒

2．1．4 主要培养基

2．1．5 常用缓冲液

2．2 实验方法

2．2．1 基因组的提取

2．2．2 菌株HS-NH1分子鉴定

2．2．3 peh基因簇相关基因的扩增

2．2．4 peh基因簇的原核表达

2．2．5 牛血清蛋白和DOP标准曲线的构建

2．2．6 Peh催化活性的分析方法

2．2．7 ABC转运蛋白基因簇顺序的分析

2．2．8 ABC与MFS转运蛋白的敲除质粒的构建

2．2．9 电转化与筛选敲除突变株

2．2．10 缺失突变体△ABC与△MFS对PAE碳源利用能力分析

第三章 结果与分析

3．1 戈登氏菌HS-NH1基因组的提取与pehA／B的克隆

3．2 重组质粒pET-pehA与pET-pehB原核表达及SDS-PAGE分析

3．3 蛋白浓度与DOP和PA标准曲线的构建

3．4 PehA／B粗酶液活性分析

3．5 ABC转运蛋白基因簇ptr顺序检测及MFS／ABC转运蛋白基因敲除质粒构建

3．6 HS-NH1-△ABC与HS-NH1-△MFS对PAE碳源利用能力分析

讨论

参考文献

硕士期间发表论文

致谢