恩施高富硒植物碎米荠含硒多糖研究

摘要

湖北恩施州高山地区生长着一种高富硒植物——碎米荠(Cardamine)。该植物不仅硒含量高，而且是一种药食两用植物。为了开发利用碎米荠植物资源，本文以湖北恩施碎米荠干制粉末为原料，选择含硒多糖为研究切入点，对碎米荠含硒多糖的分离纯化特性进行了系统探讨，为碎米荠植物资源的开发利用提供理论和实践依据。主要研究结果如下： 1. 碎米荠多糖定量测定方法的评价 根据检测方法的重现性、精密度、回收率和稳定性等指标来评价检测方法的可行性，定量测定碎米荠多糖可以采用苯酚-硫酸比色法。同时发现，组成碎米荠多糖的单糖残基以吡喃糖为主。 2. 碎米荠粗多糖的浸提特性 为探讨碎米荠粗多糖的浸提特性，以1g碎米荠干粉为试验材料，选择蒸馏水为浸提剂，首先研究浸提温度、浸提时间、浸取剂用量、提取次数和浸提液pH值等单因素对碎米荠粗多糖提取量的影响规律，然后设计四元二次通用旋转组合试验方案研究多因素对碎米荠粗多糖提取量的综合影响。结果表明，浸提温度、浸提时间、浸取剂用量、提取次数和浸提液pH值等单因素对碎米荠粗多糖提取量有显著影响；浸提温度90℃、浸提时间3 h、浸取剂用量30 ml、提取次数5次和浸提液pH值为9是碎米荠粗多糖适宜的提取条件，粗多糖提取量达到4．76％。 3. 乙醇沉淀碎米荠粗多糖的规律 为探讨乙醇沉淀碎米荠粗多糖的特点，首先考察乙醇浓度对多糖沉淀量的影响，然后研究乙醇沉淀次数对多糖沉淀量的影响。结果表明，90％(V/V)的乙醇浓度是碎米荠粗多糖的最佳沉淀浓度；用90％的乙醇对沉淀的碎米荠粗多糖经蒸馏水溶解后再沉淀一次，不但可以最大程度地将碎米荠粗多糖提取液中的多糖沉淀出来，而且沉淀的碎米荠粗多糖得到了一定程度的纯化，有利于后续粗多糖分离纯化过程的进行。 4. 碎米荠多糖共沉淀物的分离纯化方法 乙醇在沉淀碎米荠粗多糖提取液中的多糖时，有一种未知化合物与多糖一起被沉淀，为了将多糖共沉淀物与多糖分离，首先用磷酸氢二钠絮凝粗多糖提取液。离心后，收集沉淀，上清液加入磷酸氢二钠絮凝共沉淀物，反复上述操作到上清液加入磷酸氢二钠无絮凝现象，合并沉淀，将沉淀用适量的蒸馏水溶解。向溶液中加入丙酮，丙酮沉淀的多糖与共沉淀物再用蒸馏水溶解，溶液用磷酸氢二钠絮凝沉淀，离心后，沉淀经蒸馏水溶解用磷酸氢二钠絮凝，如此反复将沉淀溶解、丙酮沉淀、磷酸氢二钠絮凝，直到共沉淀物经硫酸-苯酚法检测呈阴性为止。然后用大孔树脂吸附层析对共沉淀物进行分离纯化，层析条件是：一定浓度的样品40 ml上柱，以流速1.2 ml/min进行动态吸附，再用浓度30％-80％的甲醇以流速2.5 ml/min通过树脂床进行梯度洗脱；最后用琼脂糖(Sepharose)6B(20×400mm)凝胶过滤层析将共沉淀物进一步纯化，层析条件是：上样量3 ml，蒸馏水洗脱，控制洗脱流速为1.5 ml/min。 5. 共沉淀物纯度鉴定及其结构表征 纯化的共沉淀物用高效液相色谱法进行纯度鉴定，用质谱法对其结构进行分析。结果表明共沉淀物为高效液相色谱纯，是一种以连接有羟基的五元环和六元环烷烃为母核，母核之间有羧酸酯键的大分子化合物。 6. 碎米荠共沉淀物的絮凝规律 为探讨碎米荠共沉淀物的絮凝特性，选择磷酸氢二钠和氢氧化钙为絮凝试剂，通过磷酸氢二钠和氢氧化钙用量、pH值等单个因素对共沉淀物絮凝量影响的研究及其上述两个因素对共沉淀物絮凝量综合影响的研究，发现影响共沉淀物絮凝量的因素是碱性的絮凝体系和金属离子的存在，碱性条件对共沉淀物絮凝量的影响比金属离子大。 7. 碎米荠粗多糖的色素共存特性 色素与碎米荠粗多糖共存时，为了研究碎米荠色素在粗多糖溶液中被脱除的基本特性，以活性炭为吸附剂，在脱色温度、脱色时间与活性炭用量等单因素试验的基础上，进行了三因素三水平的正交试验。试验结果经方差分析发现，上述单因素对碎米荠色素的脱除有显著影响，并得到脱除碎米荠粗多糖色素的适宜条件为脱色温度80℃，脱色时间4 h，活性炭用量0.8％。为尽量减少粗多糖被活性炭吸附造成的损失，以蒸馏水为解吸剂，选择解吸温度、解吸时间及解吸剂用量为试验因素进行九水平均匀试验，用回归分析对其试验数据进行分析，发现碎米荠色素与多糖之间以非结合态形式共同存在粗多糖溶液中，并得出解吸粗多糖的适宜条件为解吸时间100 min，解吸温度78℃，蒸馏水用量为活性炭的10倍，可有效解吸粗多糖，减少粗多糖的损失。 8. 碎米荠粗多糖的蛋白质共存特性 蛋白质与碎米荠粗多糖共存时，为了研究蛋白质在粗多糖溶液中被脱除的基本特性，以三氯乙酸为脱除碎米荠粗多糖溶液中蛋白质的试剂，进行了三氯乙酸浓度、脱除温度和脱除时间等单因素试验和三氯乙酸浓度和处理时间二因素九水平均匀试验。试验结果经方差和回归分析发现，温度对蛋白质脱除没有影响，三氯乙酸浓度和脱除时间对蛋白质脱除的影响存在显著关系，并得到脱蛋白的适宜条件：室温下，选择4％的三氯乙酸浓度，脱除时间12-16h。 9. 碎米荠含硒多糖的纯化方法 首先采用纤维素阴离子(DEAE-52)柱层析将中性和酸性含硒多糖分开，然后用葡聚糖G-100凝胶柱层析将中性含硒多糖和酸性含硒多糖进行纯化，分别得到一个中性含硒多糖组分和两个酸性含硒多糖组分。高效液相色谱法鉴定中性含硒多糖(Se-P Ⅰ)的纯度为色谱纯，含量较大的酸性含硒多糖(Se-PⅡ)组分鉴定出两个组分，其中一个组分为含硒多糖，另一个为未知组分。 10. 碎米荠含硒多糖Se-PⅠ的结构表征 采用化学法、气相色谱、气相色谱-质谱联用、红外光谱以及核磁共振等现代分析方法对纯化的碎米荠含硒多糖Se-PⅠ结构进行了初步研究，研究结果表明，碎米荠含硒多糖Se-PⅠ是一种含有D-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖的杂聚多糖，单糖残基的环型为吡喃型，构型有α-和β-型，葡萄糖和半乳糖残基与其它单糖残基成苷时均在C-1和C-5上。

目录

文摘

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声明

第一章绪论

1.1碎米荠的药用价值

1.2含硒多糖的生物功能

1.2.1硒的生物功能

1.2.2多糖的生物功能

1.2.3含硒多糖的生物功能

1.3含硒多糖的分离纯化方法

1.4选题依据

1.5研究目的及意义

1.6本文的研究思路

第二章碎米荠粗多糖定量测定方法的验证

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2方法

2.2结果与分析

2.2.1碎米荠多糖的最大吸收波长扫描结果

2.2.2葡萄糖标准曲线的建立结果

2.2.3多糖换算因子的测定结果

2.2.4苯酚—硫酸比色法测定碎米荠多糖的重现性试验结果

2.2.5苯酚—硫酸比色法测定碎米荠多糖的精密度试验结果

2.2.6苯酚—硫酸比色法测定碎米荠多糖的回收率试验结果

2.2.7苯酚—硫酸比色法测定碎米荠多糖的稳定性试验结果

2.3讨论

2.3.1苯酚—硫酸比色法测定多糖含量的基本原理

2.3.2初步推断六炭糖(吡喃糖)是碎米荠多糖的主要存在形式

2.3.3苯酚—硫酸比色法测定时浓硫酸加入后须在沸水浴中加热

2.4小结

第三章碎米荠水溶性粗多糖的浸提特性

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2试验方法

3.2结果与分析

3.2.1提取时间对碎米荠粗多糖浸提特性的影响

3.2.2温度对碎米荠粗多糖浸提特性的影响

3.2.3提取次数对碎米荠粗多糖浸提特性的影响

3.2.4浸取剂用量对碎米荠粗多糖浸提特性的影响

3.2.5 pH对碎米荠粗多糖浸提特性的影响

3.2.6多因素对碎米荠粗多糖浸提特性的影响

3.3讨论

3.3.1碎米荠粗多糖的浸提机理

3.3.2碎米荠硒多糖分离纯化过程中含硒量的检测

3.3.3 pH对粗多糖提取量的影响

3.3.4浸提剂用量对粗多糖提取量的影响

3.3.5温度对粗多糖提取量的影响

3.4小结

第四章乙醇沉淀碎米荠粗多糖的规律

4.1材料与方法

4.1.1材料

4.1.2试验方法

4.2结果与分析

4.2.1不同乙醇浓度对碎米荠粗多糖沉淀量的影响结果

4.2.2乙醇沉淀次数对碎米荠粗多糖沉淀量的影响结果

4.3讨论

4.3.1乙醇沉淀粗多糖的最佳浓度

4.3.2乙醇反复沉淀粗多糖在多糖分离纯化过程中的作用

4.3.3乙醇沉淀粗多糖的基本原理

4.4结论

第五章碎米荠醇沉多糖的共沉淀物探讨

5.1材料与方法

5.1.1材料

5.1.2试验方法

5.2结果与分析

5.2.1共沉淀物检测波长的扫描结果

5.2.2共沉淀物的纯化试验结果

5.2.3碎米荠共沉淀物的纯度鉴定结果

5.2.4碎米荠共沉淀物的结构表征结果

5.2.5碎米荠共沉淀物的理化性质

5.2.6共沉淀物在不同絮凝试剂中的絮凝现象

5.2.7共沉淀物的絮凝规律

5.3讨论

5.3.1大孔树脂对共沉淀物的吸附特性

5.3.2共沉淀物的浓度不同其大孔树脂柱层析条件会有所变化

5.3.3共沉淀物浓度的精确定量难度很大

5.3.4共沉淀物絮凝的基本原理

5.3.5碎米荠共沉淀物分子中官能团结构与相关性质的关系

5.3.6碎米荠共沉淀物与多糖结构的相似性

5.3.7碎米荠共沉淀物中没有硒存在

5.3.8碱性条件是共沉淀物絮凝必不可少的条件

5.3.9金属离子的存在对共沉淀物的絮凝有一定的影响

5.3.10氢氧化钙对共沉淀物的絮凝能力比磷酸氢二钠强

5.4小结

第六章碎米荠粗多糖的色素共存特性

6.1材料与方法

6.1.1材料

6.1.1方法

6.2结果与分析

6.2.1温度对活性炭脱除碎米荠粗多糖色素的影响结果

6.2.2时间对活性炭脱除碎米荠粗多糖色素的影响结果

6.2.3活性炭用量对脱除碎米荠粗多糖色素的影响结果

6.2.4活性炭脱除碎米荠粗多糖色素的正交试验结果

6.2.5碎米荠粗多糖解吸试验结果

6.3讨论

6.3.1活性炭脱除粗多糖色素的基本原理

6.3.2活性炭解吸的基本原理

6.3.3碎米荠色素与粗多糖的解吸特性不同

6.3.4碎米荠色素与粗多糖之间的赋存关系

6.4小结

第七章碎米荠粗多糖的蛋白质共存特性

7.1材料与方法

7.1.1材料

7.1.2试验方法

7.2结果与分析

7.2.1考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的回归方程

7.2.2三氯乙酸浓度对蛋白质去除的影响结果

7.2.3时间对三氯乙酸去除蛋白质的影响结果

7.2.4温度对三氯乙酸去除蛋白质的影响结果

7.2.5三氯乙酸去除蛋白质的均匀试验结果

7.3讨论

7.3.1温度对碎米荠多糖溶液中蛋白质的去除没有影响

7.3.2碎米荠多糖溶液中蛋白质的去除机理

7.3.3研究和实践中，三氯乙酸浓度和处理时间的选择受到限制

7.3.4三氯乙酸法适合于含吡喃糖残基的多糖蛋白质脱除

7.4小结

第八章碎米荠含硒多糖的纯化方法

8.1材料与方法

8.1.1材料

8.1.2试验方法

8.2结果与分析

8.2.1碎米荠含硒多糖的纤维素阴离子柱层析结果

8.2.2碎米荠含硒多糖的葡聚糖G-100凝胶柱层析结果

8.2.3含硒多糖的硒含量测定结果

8.2.4含硒多糖Se-PⅠ的纯度鉴定结果

8.3讨论

8.3.1含硒多糖Se-PⅡ结构的复杂性

8.3.2硒在碎米荠多糖中的赋存特点

8.3.2硒在碎米荠植物中的赋存形态

8.4小结

第九章碎米荠含硒多糖Se-PⅠ的结构表征

9.1材料与方法

9.1.1材料

9.1.2试验方法

8.2结果与分析

8.2.1含硒多糖Se-PⅠ的分子量测定结果

8.2.2含硒多糖Se-PⅠ的结构表征结果

9.3讨论

9.3.1含硒多糖结构解析的复杂性

9.3.2结构不同的多糖运用现代分析技术分析的条件各不相同

9.3.3硒在碎米荠多糖中的赋存形态

9.4小结

全文总结

主要参考文献

致谢

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