猪圆环病毒感染性分子克隆构建及siRNA对rep基因表达抑制研究

摘要

猪圆环病毒(PCV)是当前严重危害世界养猪业的重要病原之一。PCV除了是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎和肾病综合征(PDNS)等新发重大传染病的“罪魁祸首”之外，还可以导致母猪繁殖障碍、猪呼吸道综合征、仔猪先天性震颤等诸多疾病。同时，该病毒感染主要侵害机体的免疫系统，导致免疫抑制，造成继发感染。PCV对养猪业造成的直接、间接损失十分巨大，从而备受世界兽医界的关注。此外，猪群中广泛存在着PCV感染，在猪的器官及食源性产品中PCV检出率也较高。故PCV还存在突破种间屏障并通过食物或器官移植等途径传播给人的潜在可能。但到目前，世界上还没有一种有效方法应对PCV感染。寻求预防、治疗PCV感染的途径显得尤为迫切。 本论文主要在PCV的诊断方法、感染性分子克隆和siRNA对PCV1rep基因表达的抑制作用等三方面开展了研究，为PCV的基因功能和免疫预防研究奠定基础。主要研究内容如下：1.PCV2、PRV和PPV多重PCR诊断方法的建立与应用利用三对PCR引物建立了同时检测猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)的多重PCR诊断方法。用该方法对137份PCV2阳性病料进行PCR检测，结果显示：在137份PCV2阳性病料中有78份同时检测到了PPV，46份检测到了PRV，35份检测到了PRV和PPV，检测结果与已经建立的单一PCR方法完全相同。表明：建立的多重PCR具有高度的准确性，可以用于临床PCV2、PRV和PPV的快速诊断；PPV和PRV易与PCV2发生混合感染，并在导致动物发病过程中发挥重要作用。 2.PCV1感染性分子克隆的构建从IBRS-2细胞中分离鉴定了PCV1，并通过PCR方法获得了其全基因组序列，序列分析表明该毒株与其它PCV1毒株间的同源性都在98％以上；构建了PCV．1双拷贝全基因组串连质粒pSK2PCV1，经RT-PCR和间接免疫荧光初步证实pSK2PCV1质粒转染PK-15细胞后可以形成具有感染性的病毒。 3.嵌合病毒PCV1-2感染性分子克隆的构建利用PCR方法，将PCV2的ORF2基因替换了PCV1的ORF2基因，并在此基础上构建了双拷贝的嵌合病毒(PCV1-2)分子克隆(pSK2PCV1-2)；将该质粒转染PK-15细胞并连续盲传5代，用RT-PCR方法可以在转染后盲传的细胞中检测到PCV1的ORF1mRNA和PCV2的ORF2mRNA基因，但检测不到PCV1的ORF2基因mRNA和PCV2的ORF1基因mRNA;间接免疫荧光检测显示在盲传第5代的细胞中有PCV2ORF2蛋白的表达，表达蛋白主要分布于细胞核。表明：构建的PCV1-2分子克隆转染细胞后形成了具有感染性的嵌合病毒。 4.siRNA对PCV1rep基因表达的抑制作用研究以PCV1的ORF1基因的mRNA为靶序列，设计合成了3个siRNA，并构建了各自的表达质粒；构建了rep基因与EGFP融合的真核表达质粒(pCDPCV1ORF1-EGFP)，并实现了二者在PK-15细胞中的融合表达，rep基因表达蛋白呈弥散性分布于整个细胞；将siRNA表达质粒与pCDPCV1ORF1-EGFP共转染PK-15细胞后，通过荧光观察、流式细胞和半定量RT-PCR等方法证实：3个siRNA均对rep基因的表达产生了显著的抑制作用，其中siRNA(C)的抑制作用最强，siRNA(B)次之，siRNA(A)最弱。 5.以EGFP为报告基因的PCV1分子克隆的构建利用PCR方法将报告基因EGFP插入到PCV1的ORF2基因的下游，并在此基础上构建了包含EGFP的双拷贝PCV1的分子克隆(pSK2PCV1-EGFP)；该质粒转染PK-15细胞48小时后可以在细胞中检测到特异性荧光，荧光主要分布于细胞核，表明在转染细胞中有PCV1的ORF2和EGFP蛋白的表达；将转染后的细胞连续盲传3代，结果在盲传后检测不到荧光。表明：pSK2PCV1-EGFP转染细胞后虽然有PCV1基因的表达，但不能传代。

目录

摘要

第一章文献综述

1.1猪圆环病毒——一种“新发现”的病毒

1.1.1病毒的发现

1.1.2病毒的特性

1.1.3PCV基因组分子结构

1.1.4PCV的复制与转录机制

1.1.5Cap的功能与应用

1.1.6PCV流行病学

1.1.7病毒遗传演化

1.1.8PCV相关疾病

1.1.9致病机理

1.1.10 PCV与人类健康

1.1.11诊断方法研究

1.1.12免疫预防

1.2RNAi——抗病毒感染的新途径

第二章多重PCR方法检测猪Ⅱ型圆环病毒和细小病毒及伪狂犬病毒

2.1研究目的和意义

2.2材料与方法

2.3结果

2.4讨论

2.5 小结

第三章猪Ⅰ型圆环病毒全基因组克隆与感染性鉴定

3.1研究目的与意义

3.2材料与方法

3.3结果

3.4讨论

3.5 小结

第四章嵌合猪圆环病毒PCV1-2的构建及其感染性初步鉴定

4.1研究目的与意义

4.2材料与方法

4.3结果

4.4讨论

4.5小结

第五章siRNA对PCV1 rep基因表达抑制的研究

5.1研究目的与意义

5.2材料与方法

5.3结果

5.4讨论

5.5小结

第六章以EGFP为报告基因的PCV1分子克隆的构建

6.1研究目的与意义

6.2材料与方法

6.3结果

6.4讨论

6.5小结

结论

参考文献

缩略词表（Abbreviation）

博士在读期间发表论文及主持或参与的科研项目

致谢