枯草芽孢杆菌B411的绿色荧光蛋白标记及其水体净化作用的研究

摘要

本课题主要包括两个方面的研究：(1)枯草芽孢杆菌B411的绿色荧光蛋白标记。以质粒pAD123为模板扩增出绿色荧光蛋白基因(gfp)编码序列，连接到枯草芽孢杆菌整合载体pAXc，构建重组质粒pAXc-gfp。pAXc-gfp线性化后转化B411菌株，获得重组子B412，以B412为指示菌投放入水体，利用其荧光标记跟踪检测了B412在水体中的消长，结果表明B412在无抗生素压力下能稳定表达GFP蛋白，菌体在水体中能存活较长时间(＞16d)，试验期间菌数变化介于5.5×103cfu/ml～8.9×104cfu/ml之间。(2)枯草芽孢杆菌B411水体净化作用的研究。人工模拟了水体老化的过程，分析了有机质种类、有机质浓度、溶氧、温度、酸碱度、底泥及净水微生物与水体老化的关系。研究了自然环境下投菌对水体老化的影响。结果表明，水体老化是有机质、溶氧、温度等各因素综合作用的结果。有机质种类与水体老化的关系：含蛋白质丰富的水体，老化速度最快，含糖类丰富的水体，老化速度最慢。有机质浓度与水体老化的关系：在低溶氧下(＜=0.10mg/L)，有机质浓度低于0.1‰时，水体不老化，有机质浓度超过一定值(＞=0.2‰)时水体老化，且水体老化并不与有机质浓度一一相关，老化顺序依次为0.2‰、0.4‰、0.6‰、0.8‰和1.0‰：高溶氧下(＞=1.34mg/L)，有机质浓度低于0.4‰时水体不老化，高于或等于0.4‰是水体老化有不同程度发生，老化顺序与有机质含量一一相关，依次为1.0‰、0.8‰、0.6‰和0.4‰。温度与水体老化的关系：温度(15℃、20℃)较低能延缓或避免水体老化，较高温度(25℃、30℃)时水体老化速度较快，第4天时水体开始变黑，20℃和15℃培养的水体在同一时间下几乎无变化。pH与水体老化的关系：pH7.5时水体老化速度最快，第3天开始老化，偏碱(pH＞9.0)或偏酸(pH＜6.0)能延缓水体老化，第4天时才开始老化，pH6.0的水体较pH9.0的水体老化程度轻。底泥与水体老化的关系：底泥能促进水体老化，底泥不灭菌的水体中，6天内COD去除率达60.1％，高出不加底泥的水体18.6％。投菌量与水体老化的关系：投菌量为104cfu/ml和105cfu/ml时COD去除效果最好，去除率分别为90.1％和91.3％，明显高于其它处理及对照。不同溶氧水平下投菌与水体老化的关系：高溶氧下投菌能促进水体净化，COD去除率75.9％，低溶氧下投菌会加速水体老化，在投菌后3、4天内水体迅速变黑，COD去除率为45.7％，与低溶氧下对照COD去除率42.1％相差不大，且低于高溶氧水平下对照COD去除率55.1％。

目录

文摘

英文文摘

1前言

1.1绿色荧光蛋白(GFP)及其在生态学研究中的应用

1.1.1绿色荧光蛋白的生化性质及发光机制

1.1.2绿色荧光蛋白发光性能的改进

1.1.3绿色荧光蛋白标记的优点

1.1.4绿色荧光蛋白在生态学研究中的应用

1.2枯草芽孢杆菌及其GFP标记

1.2.1枯草芽孢杆菌的生物学特征

1.2.2枯草芽孢杆菌的GFP标记

1.3微生物净水技术在水环境治理上的应用

1.3.1在水产养殖水环境控制上的应用

1.3.2在湖泊景观水治理上的应用

1.3.3微生物净水技术的特点和优势

1.3.4微生物净水技术在非养殖水体净化应用中存在的问题

1.4本课题研究的目的和意义

2实验材料和方法

2.1实验材料

2.1.1主要仪器设备

2.1.2菌株和质粒

2.1.3工具酶

2.1.4试剂

2.1.5培养基

2.1.6 PCR引物

2.2实验方法

2.2.1重组质粒的构建

2.2.2大肠杆菌的转化

2.2.3枯草芽孢杆菌转化(二步法)

2.2.4水体老化过程的模拟及水体老化的影响因素

2.2.5人工投放净水微生物对水体老化的影响和作用

2.2.6自然条件下投菌对水体老化的影响

3结果与分析

3.1标记菌株的构建

3.1.1绿色荧光蛋白基因的扩增

3.1.2克隆片断方向的正确性验证

3.1.3重组表达载体的特征

3.1.4枯草芽孢杆菌出现感受态时间的确定

3.1.5转化结果及荧光稳定性检测

3.1.6标记菌株B412与未标记菌株B411的比较

3.1.7标记菌株在水体中的应用研究

3.2水体老化过程的模拟及水体老化的影响因素

3.2.1水体老化的定义

3.2.2有机质种类与水体老化

3.2.3不增氧条件下有机质含量与水体老化

3.2.4增氧条件下有机质含量与水体老化

3.2.5有机质的投加方式与水体老化

3.2.6溶氧与水体老化

3.2.7酸碱度与水体老化

3.2.8温度与水体老化

3.2.9底泥与水体老化

3.3人工投放净水微生物对水体老化的影响和作用

3.3.1投菌量的确定

3.3.2投菌量与水体老化

3.3.3不同溶氧水平下投菌对水体老化的影响

3.4自然条件下投菌与水体老化

3.4.1 COD值

3.4.2水体颜色的变化

4小结与讨论

4.1转化枯草芽孢杆菌

4.2绿色荧光蛋白标记系统

4.3水体老化的影响因素

4.4投菌对水体老化的影响和作用

参考文献

致谢