蜂产品中土霉素残留的酶联免疫检测

摘要

该研究通过制备土霉素(oxytetracycline，OTC)的特异性抗体，建立了蜂产品中土霉素残留的酶联免疫吸附分析法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)。具体包括以下四个方面的内容： 1.土霉素人工抗原的构建OTC分子量为460.2，是只有反应原性而无免疫原性的小分子物质，必须与蛋白质等载体结合转化为完全抗原后才能刺激动物产生抗体。由于OTC分子结构中含有氨基，所以可以以该基团为“桥梁”将OTC和载体蛋白连接起来。 该研究首先分别以碳化二亚胺(1-ethy1-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride，EDC)和戊二醛(commercialglutaraldehyde，GA)作为偶联剂，将OTC与牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA)进行偶联，合成了复合物OTC-BSA，并分析了不同连接剂对蛋白偶联效果的影响。结果表明，以EDC或GA为偶联剂，均可得到OTC与BSA的偶联物，但是偶联物中OTC与BSA的摩尔比有很大的差异，以EDC为偶联剂时OTC：BSA摩尔比为4.00：1，而以GA作为偶联剂时仅为2.58：1，这说明EDC的偶联效果比GA的好。 进一步就OTC与BSA偶联时，BSA、OTC及偶联剂的混合方法对偶联物摩尔比的影响进行了研究，结果显示，向BSA溶液中边搅拌边缓慢地滴加OTC和EDC溶液时OTC-BSA偶联物中OTC与BSA的摩尔比较高，达7.97：1。该连接物注射BALB/c小鼠后能获得较好的抗体。 该研究还在上述研究的基础上制备了OTC与卵清白蛋白(ovalbumin，OV)的偶联物OTC-OV。 2.抗OTC抗体的制备以自制的OTC-BSA(摩尔比为7.97：1)连接物为免疫抗原注射BALB/c小白鼠，从抗体的产生进程来看，小鼠在第一次免疫后45天开始有明显的抗体产生，90天达到高峰，然后开始下降，间接非竞争ELISA测得其最高效价为1：20,000；进一步用间接竞争ELISA分析了此抗体的灵敏度与特异性，结果表明，所得抗体的灵敏度和特异性都较好，和其它结构相似或相近物质的交叉反应率较低。 3.几种蜂产品中OTC的ELISA检测对蜂蜜、蜂花粉、蜂王浆中OTC的提取方法进行了研究，得出了它们的最佳提取方法和条件。以自制的抗血清建立的间接竞争ELISA法对几种蜂产品中OTC的残留量进行了检测，所建立的间接竞争ELISA方法对土霉素的检测范围为5～200ng/ml，相关系数r=0.9951，在此范围内对人工污染样品的平均回收率为97.5％～107.0％。 4.试剂盒的试制在上述研究基础上进行了ELISA试剂盒的试制，ELISA试剂盒经适当处理后，4℃放置2个月和-20℃放置2.5个月，以间接非竞争ELISA测定的吸光值分别是起始时的1/10和1/3。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

第一章文献综述

1动物源性食品中的抗生素残留及安全控制

1.1抗生素残留的原因及现状

1.2抗生素残留对人体的危害

1.3抗生素残留的安全控制

2抗生素残留检测方法研究进展

2.1抗生素残留的微生物检测

2.2抗生素残留的仪器分析

2.3抗生素残留的免疫测定

3蜂产品中抗生素的残留及其检测

3.1蜂产品的营养价值

3.2蜂产品中的抗生素残留

3.3土霉素的理化性质及其残留对人体的危害

3.4蜂产品中抗生素残留的检测

4本课题的研究目的

第二章土霉素人工抗原的合成

引言

1材料与方法

1.1主要试剂

1.2主要仪器

1.3方法

2结果与分析

2.1偶联剂对抗原合成的影响

2.2偶联剂添加方法对抗原合成的影响

3小结与讨论

第三章抗土霉素抗体的制备及ELISA方法的建立

引言

1材料与方法

1.1主要试剂

1.2试验动物和细胞

1.3主要仪器

1.4溶液系统

1.5方法

2结果与分析

2.1抗体的产生进程

2.2间接非竞争ELISA法检测抗体的效价

2.3抗原抗体反应影响因素的分析

2.4抗体的ELISA灵敏度与特异性

3.小结与讨论

第四章蜂产品中土霉素残留的免疫检测

引言

1.材料与方法

1.1材料

1.2主要试剂

1.3主要仪器

1.4方法

2结果与分析

2.1蜂产品中OTC的加标回收

2.2蜂产品中土霉素残留的ELISA检测

2.3 ELISA试剂盒的试制

3小结与讨论

第五章总结与讨论

1总结

2讨论

2.1半抗原连接位点的选择

2.2偶联物中半抗原与载体蛋白的摩尔比

2.3 ELISA试剂盒的试制

2.4影响ELISA方法准确性的因素

参考文献

致 谢

附 录