淹水胁迫下薏苡乙醇脱氢酶（ADH1）和丙酮酸脱羧酶（PDC1）基因cDNA片段的克隆及其表达的初步分析

摘要

利用玉米、水稻、小麦的ADH1和PDC1基因保守序列设计两对特异性引物，采用RT-PCR的方法，以薏苡为材料，扩增出ADH1及PDC1基因cDNA的部分编码区，用半定量RT-PCR的方法研究了淹水胁迫下ADH1和PDC1的表达特性及其与之对应的酶活性变化规律，主要结果如下： 1．提取了薏苡根尖及叶片总RNA，RNA完整性较好，经电泳检测可看到明显的条带，叶片中28sRNA亮度基本为18sRNA的两倍，且5sRNA清晰可见无拖尾现象；根部中的RNA稍有弥散，但28sRNA和18sRNA仍能分开。测得的紫外吸光值OD260/OD280都在2．0左右，显示得率较高，表明提出的RNA质量好、纯度高。 2．利用设计的两对特异性引物以薏苡根尖总RNA为材料，通过RT-PCR分别扩增出743bp和498bp的ADH1、PDC1基因的部分cDNA序列，均包含部分的编码区，分别编码247和162个氨基酸的成熟多肽。生物信息学分析发现：所得到的薏苡ADH1基因核苷酸序列与大麦（Hordeum vulgare），水稻（O．sativa）、玉米（Zea mays）的相似性分别为87％、89％、90％，氨基酸的相似性分别为940％、940％、95％；PDC1与玉米、水稻PDC1基因相似性高达95％、91％，氨基酸相似性为97％、95％。编码的多肽均具亲水性，都存在跨膜序列及多处翻译后修饰，ADH1编码多肽的等电点及分子量分别为6．14、26．1KD，PDC1编码多肽的等电点及分子量为5．30、17．8kD。进化树分析表明：无论是ADH1基因还是PDC1基因编码的蛋白在起源上与禾本科植物最接近，均包含部分保守的活性位点，推测分别由共同的祖先进化而来。两基因片段在GenBank登录号分别为DQ455071、DQ455583。 3．半定量RT-PCR方法分析了淹水胁迫下薏苡根尖及叶片ADH1、PDC1的表达模式，结果表明：ADH1、PDC1基因在根尖组织里有较高的表达丰度，而在叶片中都很低。在根尖中ADH1表达量在第4h便达到峰值，PDC1稍滞后，但在第8h时，其表达量也达到最高。在叶片中ADH1、PDC1表达量的变化不明显，无论在根尖还是叶片对应时间点的ADH1的丰度均比PDC1高。对应的酶活性变化情况是：根尖ADH酶在第6h达到最大值，为179．21U/mg protein，PDC酶在第10h达到最高点为150．11U/mg protein；在叶片中两种酶活性略有上升，但并不明显。整体上看，ADH1、PDC1基因mRAN相对量的变化与对应的酶活性变化并非线性对应关系，暗示可能存在转录后的调控

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论文说明：缩略词表

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第一章文献综述

1植物基因克隆方法概述

1.1正向遗传学与基因克隆策略

1.2反向遗传学与基因克隆策略

1.3TILLING技术

1.4基因陷阱

2植物厌氧响应相关基因的表达调控机制

2.1厌氧应答基因序列特点

2.2高等植物感受厌氧信号的模式

2.3厌氧响应相关基因的表达调控特点

2.4.AtMYB2参与厌氧反应的调控

3.研究的目的与意义

第二章薏苡乙醇脱氢酶(ADH1)及丙酮酸脱羧酶(PDC1)基因cDNA的克隆

1材料与方法

1.1材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1薏苡根部及叶片RNA提取

2.2cDNA的合成及其质量的检测

2.3目的基因扩增条件的优化

2.4薏苡ADH1及PDC1基因的扩增

2.5阳性克隆的筛选及鉴定

2.6序列的测定

3讨论

3.1有关薏苡RNA的提取

3.2关于RT-PCR与质粒的转化及克隆

第三章薏苡乙醇脱氢酶(ADH1)及丙酮酸脱羧酶(PDC1)基因cDNA的生物信息学分析

1.材料与方法

1.1材料

1.2生物信息学分析方法

2结果与分析

2.1ADH1基因核苷酸序列分析

2.2ADH1基因编码的氨基酸序列分析

2.3.ADH1基因的分子进化分析

2.4PDC1基因核苷酸序列分析

2.5PDC1基因编码的氨基酸的序列分析

2.6PDC基因家族的分子进化分析

3讨论

第四章ADH1、PDC1基因淹水胁迫下的表达模式及酶活性变化分析

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果及分析

2.1循环参数的确定

2.2薏苡根尖ADH1、PDC1基因表达的相对定量结果

2.3薏苡叶片ADH1、PDC1基因表达的相对定量结果

2.4ADH、PDC酶活力变化情况

3.讨论

3.1.关于半定量RT-PCR技术

3.2ADH1，PDC1表达量及酶活力与耐渍性关系

参考文献

致谢