运动发酵单胞菌乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

摘要

该论文以Zymomonas mobilis DNA为模板,PCR扩增Zymomonas mobilis中的乙醇脱氢酶基因（adhB）和丙酮酸脱羧酶基因（pdc）,分别构建表达质粒pSE-andB和pSE-pdc并在大肠杆菌DH5α中表达.在乙醛指示平板上均能检测到它们的活性.SDS-PAGE电泳分析表明：有表达分子量为40KD（ADHⅡ）和60KD（PDC）的蛋白质.因此可用于多顺反子表达质粒构建试验.该研究成功地将adhB和pdc基因引入大肠杆菌,在大肠杆菌中建立了一条新的代谢葡萄生成乙醇的途径,同类研究在国内尚无报道.

目录

文摘

英文文摘

第一章前言

1.1运动发酵单胞菌

1.2大肠杆菌

1.3技术路线

第二章材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌株与质粒

2.1.2酶与试剂

2.1.3主要仪器设备

2.1.4常用缓冲液配方

2.2方法与步骤

2.2.1 Zymomonas mobilis的复苏培养

2.2.2菌种的保存

2.2.3 Zymomonas mobilis基因组总DNA的制备

2.2.4乙醇脱氢酶基因(adhB)和丙酮脱羧酶基因(pdc)的引物设计和PCR扩增

2.2.5大肠杆菌感受态的制备

2.2.6质粒DNA的大量制备

2.2.7少量提取质粒

2.2.8 DNA的酶切与连接

2.2.9连接产物对大肠杆菌感受态细胞的转化

2.2.10阳性克隆的筛选和酶切验证

2.2.11重组子的质粒PCR验证

2.2.12rrnB终止子(terminator)的克隆和PCR扩增

2.2.13含RBS序列的adhB基因克隆

2.2.14菌液PCR

2.2.15乙醇脱氢酶的定性实验

2.2.16丙酮酸脱羧酶的定性实验

2.2.17外源基因在大肠杆菌中的表达检测

2.2.18蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.2.19重组大肠杆菌利用葡萄糖的摇瓶发酵实验

2.2.20重组大肠杆菌利用木糖的摇瓶发酵实验

第三章结果和分析

3.1乙醇脱氢酶基因(adhB基因)表达质粒的构建

3.1.1 adhB基因的克隆

3.1.2 pGEM-3zf+重组克隆质粒的验证

3.1.3乙醇脱氢酶基因(adhB)基因的序列分析

3.1.4乙醇脱氢酶基因(adhB)与pSE380载体的连接

3.1.5乙醇脱氢酶的定性检测

3.1.6表达产物的SDS-PAGE分析

3.2丙酮酸脱羧酶基因(pdc)表达质粒的构建

3.2.1 pdc基因的克隆

3.2.2 pGEM-3zf+重组克隆质粒的验证

3.2.3 pdc基因的序列分析

3.2.4丙酮酸脱羧酶基因(pdc)与pSE380载体的连接

3.2.5丙酮酸脱羧酶的定性检测

3.2.6表达产物的SDS-PAGE分析

3.3多顺反子表达质粒的构建

3.3.1多顺反子表达质粒的构建如下

3.3.2 rrnB终止子(terminator)的克隆

3.3.3 terminator与pSE-pdc的连接

3.3.4含RBS序列的adhB基因克隆

3.3.5克隆质粒的构建

3.3.6 DNA测序

3.3.7多顺反子表达质粒的构建

3.3.8酶切确定目的片段的插入方向

3.3.9表达产物的SDS-PAGE分析

3.4重组菌株葡萄糖发酵实验

3.5重组菌株木糖发酵实验

第四章讨论

4.1 DNA体外重组

4.2外源基因在大肠杆菌中的表达

4.3代谢工程的应用

4.4问题与展望

第五章结论

参考文献

致谢