补体C3d增强伪狂犬病毒gC基因免疫原性的研究

摘要

伪狂犬病（Pseudorabies）是当今危害养猪业的最重要传染病之一，免疫接种仍是目前控制和预防该病的主要手段。传统的猪伪狂犬病疫苗对控制疾病的发生和流行发挥了巨大作用，但存在毒力返强的安全隐患或免疫效果不佳等缺陷。研制更安全、高效、廉价的新型疫苗一直是伪狂犬病研究的重要方向。 近年来伪狂犬病DNA疫苗研究很多，尤其是伪狂犬病毒的囊膜蛋白gB、gC和gD为主要抗原基因的核酸疫苗报答较多。伪狂犬病毒的囊膜蛋白gB、gC和gD是病毒感染细胞的几个关键步骤中所必需的基因。正是因为如此以伪狂犬病毒的囊膜蛋白gB、gC和gD为靶抗原的核酸疫苗首免后能够比传统疫苗更有效的减少宿主感染病毒后的排放，尤其宿主在有母源抗体存在的情况下应用核酸疫苗能够更好的起到更好的免疫保护作用。然而核酸疫苗的最大缺陷是产生的抗体水平低和较慢，目前报道的可以增强伪狂犬病毒核酸疫苗的方法中有应用辛巴病毒作为载体，GM-CSF因子作为佐剂，CpG修饰，IL-2，IFN-γ等佐剂。然而尽管核酸疫苗尽管可以诱导产生比较不错的细胞免疫水平但是其产生的中和抗体水平相对于灭活和弱毒疫苗过低。补体C3d能够与靶抗原结合并有效增强抗原的体液免疫反应，C3d作为补体被抗原激活后的最后裂解产物与抗原融合表达后可以显著增强融合蛋白的免疫原性。 鉴于上述研究背景，本研究探讨了补体C3d和补体C3d的受体结合功能区M28作为分子佐剂对伪狂犬病毒最主要的保护性抗原基因gC基因的免疫增强作用，同时研究了猪源补体C3d与伪狂犬病毒gC基因融合表达的核酸疫苗的免疫效果。主要研究内容如下： 1．猪、鼠、羊补体C3d基因的克隆与序列分析 从猪、鼠、羊肝脏细胞提取总RNA，通过RT—PCR扩增出猪、鼠、羊补体C3d基因，并进行了序列测定、糖基化位点进化系统分析与序列比较，发现鼠源补体C3d基因全长897bp编码299个氨基酸，与人补体C3d核苷酸序列同源性为83％，牛与羊的C3d基因的同源性达到了94％，猪与羊、牛、人的C3d的同源性差不多都在80％左右。 2．补体C3d与gC基因融合表达重组质粒的构建和表达 以pcDNA3.1+载体作为骨干，分别构建了分泌型表达的gC基因的常规DNA疫苗表达质粒sgC和多拷贝的鼠源补体C3d分子和M28与伪狂犬病毒gC基因融合表达的DNA疫苗sgC-C3d<,3>、sgC-M28<,4>，同时构建了猪源补体C3d分子与伪狂犬病毒gC基因融合表达的DNA疫苗sgC-sC3d<,3>。将重组表达质粒转染PK-15细胞，Western blot检测证实两种表达质粒均能分泌表达gC重组蛋白。 3．补体C3d或M28与伪狂犬病毒gC基因融合表达的DNA疫苗的免疫保护 将重组表达质粒以100μg／只免疫BALB／c小鼠，三免后2周采用0.1ml×10<'5>TCID<,50>的PrV Ea株强毒攻击。连续观察两周，结果发现sgC-C3d<,3>、sgC-sC3d<,3>、sgC-M28<,4>免疫组和sgC免疫组的保护率分别为100％、100％、88％和25％。说明多拷贝的补体C3d或M28与伪狂犬病毒gC基因融合表达的DNA疫苗sgC-C3d<,3>、sgC-sC3d<,3>、sgC-M28<,4>能提供更好的免疫保护。 4．补体C3d或M28与gc基因融合表达核酸疫苗诱导的体液免疫反应 将构建的核酸疫苗免疫BALB／c小鼠（100μg／只），免疫三次每次间隔三周。免疫后每两周采集一次血，分离血清检测ELISA抗体和中和抗体。结果显示sgC-C3d<,3>或sgC-M28<,4>免疫组产生的抗体滴度显著高于sgC免疫组（P<0.01），而sgC-M284免疫组产生的抗体水平显著低于sgC-C3d<,3>免疫组的抗体水平。猪源补体C3d与伪狂犬病毒gC基因融合表达的DNA疫苗sgC-sC3d<,3>免疫组产生的抗体滴度也显著高于sgC免疫组（P<0.01）。细胞因子检测试验表明sgC-C3d<,3>、sgC-sC3d<,3>和sgC-M28<,4>免疫组产生的IL-4水平显著高于sgC免疫组（P<0.01）。sgC，sgC-C3d<,3>，sgC-M28<,4>和灭活疫苗组的中和抗体滴度在第八周分别达到了1：28，1：171，1：72和1：223。sgC免疫组的中和抗体水平在首免以及加强免疫后不同时间所产生的中和抗体均低于sgC-C3d<,3>、sgC-M28<,4>免疫组（P<0.01）。上述试验检测结果说明补体C3d或M28与伪狂犬病毒gC基因融合表达能够显著的增强单独表达gC基因的核酸疫苗的体液免疫反应。 5．补体C3d或M28与gC基因融合表达核酸疫苗诱导的细胞免疫反应 三免后2周每组取2只免疫小鼠进行淋巴细胞增殖试验分析疫苗产生的细胞免疫水平。结果显示sgC、sgC-C3d<,3>免疫组的刺激指数（SI）明显高于空白载体免疫组和灭活疫苗免疫组的SI（P（0.01）。sgC-sC3d<,3>和sgC-M28<,4>免疫组的刺激指数（SI）低于sgC、sgC-C3d<,3>免疫组产生的刺激指数（SI）。sgC-C3d<,3>免疫组的刺激指数（SI）最高并且略高于sgC免疫组（P>0.05）。灭活疫苗免疫组和空载体免疫组的刺激指数（SI）最低，并且两组的刺激指数（SI）差异不显著（P>0.05）。细胞因子检测试验表明sgC、sgC-mM28<,4>、sgC-sC3d<,3>、sgC-C3d<,3>四组IFN-γ的产生都比较相似（697pg／ml），而灭活疫苗免疫组的IFN-γ含量很低（239 pg／ml）（P<0.01）。 综上所述，我们的研究证实了补体C3d与gC基因融合可以显著的增强gC基因核酸疫苗的体液免疫反应，而且可以通过直接诱导Th2免疫反应途径来调节Thl／Th2免疫反应之间的平衡，使之产生更有效的免疫保护作用。此外，三拷贝全长补体C3d的免疫佐剂作用强于四拷贝的补体C3d受体结合功能区的作用。

目录

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摘要

第1章文献综述

第2章研究目的和意义

第3章材料与方法

第4章结果与分析

第5章讨论

第6章结论

硕士期间发表文章：

参考文献

致谢