杂种大白×梅山F代与其母本梅山猪背最长肌间差异表达基因的克隆鉴定及其特征分析

摘要

骨骼肌占肉用动物体重的.45％-60％,是动物体内最丰富的组织,其生长发育相关性状是肉用家畜最重要的性状。两种具有不同遗传基础的亲本杂交产生的后代在肌肉生长发育和肌肉品质等方面的性状往往超过双亲,产生杂种优势现象。为更好的解释和利用杂种优势,人们提出了许多假说,但都不能很好地解释杂种优势现象。随着分子生物学和遗传学的发展,人们认识到杂种优势是杂种后代和亲本之间基因差异表达的结果。为探讨杂种优势的分子机理,本研究利用抑制消减杂交技术构建了杂交子代大梅与亲代大白猪、子代大梅与亲代梅山猪背最长肌间正反向消减文库,并进行了差异表达基因的筛选、克隆、鉴定,结果如下:
　　 1.以G3PBH作为消减效率的检测指标,对每个消减文库的的消减效率进行检测,结果表明四个消消减文库的消减效率都在25以上,有的高达210倍,这表明某些特异于两种肌肉组织差异表达的基因也富集了同样的倍数,说明以上所建的消减cDNA文库质量很好。
　　 2.在每个文库随机挑选了500个以上的克隆,并进行了PCR鉴定。在以大梅为tester、梅山为driver的消减cDNA文库和以梅山为tester、大梅为driver的消减cDNA文库中分别获得了610个和580个以上的有效阳性克隆,插入片段在150-1000bp之间。
　　 3.利用反向Northern技术,以正向消减cDNA和反向未消减cDNA作探针对消减cDNA文库中的阳性克隆进行了高通量筛选。在以大梅为tester、梅山为driver的消减cDNA文库中选取了52个阳性克隆进行分析,发现共代表41个ESTs,其中32个是已知基因,9个在NCBI数据库中没有同源序列；在以梅山为tester、大梅为driver的消减cDNA文库中选取了47个阳性克隆进行分析,发现共代表36个ESTs,其中28个是已知基因,8个在NCBI数据库中没有同源序列。并利用半定量RT-PCR对其中一些ESTs进行了验证,大部分为差异表达。
　　 4.将电子克隆、SMART技术和比较基因组学相结合,成功克隆了6个基因的全长cDNA序列和3个基因的部分全长cDNA序列:(1)蛋白磷酸酶1催化亚基β-异构体(Protein phosphatase1,catalytic subunit,beta isoform,PPP1CB),GenBank登录号DQ396471,cDNA全长2759bp,ORF为984bp:(2)信号肽酶12千道尔顿亚基(Signal peptidase12 kDa subunit,SPC12),cDNA全长818bp,ORF为309bp:(3)Sarcolipin蛋白(sarcolipin,SLN),GenBank登录号DQ456976,cDNA全长727bp,ORF为96bp；(4)微小诱导细胞因子亚家族E成员1(Small induciblecytokine subfamily E,member1,SCYE1),cDNA全长1107bp,ORF为963bp:(5)核糖体蛋白L5(Ribosomal protein L5,RPLS),cDNA全长1059bp,ORF为894bp；(6)细胞色素c氧化酶Ⅶc(Cytochrome c oxidase subunitⅦc,COX7C)有两种不同长度的转录本,COX7C1(Cytochrome c oxidase subunitⅦc transcript1)cDNA全长463bp,GenBank登录号DQ456972:COX7C2(Cytochrome c oxidasesubunitⅦc transcript2)cDNA全长427bp,GenBank登录号DQ456973,ORF与COX7C1相同,均为309bp:(7)卵巢癌下调基因1(Downregulated in ovariancancer1,DOC1),cDNA长3140bp,包括3’末端和CDS全长,ORF为2682bp:(8)真核转录起始因子4E(Eukaryotic translation initiation factor4E,EIF4E),cDNA长918bp,包括5’末端和CDS全长,ORF为738bp:(9)锌指蛋白A20(Zincfinger,A20 domain containing2,ZA20D2),cDNA长2346bp,包括3’末端和CDS全长,ORF为642bp；GenBank登录号DQ492686。其中PPP1CB.SPCI2、SLN,RPL5,DOC1、ZA20D2在梅山猪中高表达,在大梅猪中低表达；SCYE1、COX7C、EIF4E在大梅猪中上调表达,在梅山猪中低表达。
　　 5.利用ORF Finder、CLUSTAL W、CDD、Signal P3.0、Prosite等软件对猪PPP1CB、SPC12、SLN、RPLS,DOC1、ZA20D2,SCYE1、COX7C、EIF4E基因结构、所编码蛋白质的结构、功能等特征进行了预测和分析,并构建了系统进化树。
　　 6.利用半定量RT-PCR技术对所获得的差异表达基因进行了不同组织(背最长肌、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、卵巢、子宫、睾丸、胚胎和脂肪)间的组织表达分析。发现猪COX7C基因的转录本COX7C1在各组织中的表达量均远大于COX7C2。
　　 7.利用比较基因组学和PCR技术,扩增了3个基因的全长基因组序列和其他基因的部分基因组序列,并分析了其在不同猪种的多态性。(1)SPC12,1651bp,包括4个外显子和3个内含子。(2)COX7C,2150bp,包括2个外显子和1个内含子。在全序列中发现7个SNP位点,其中转换突变5个,颠换突变1个,另外在梅山猪中存在一个缺失突变1个。(3)PPP1CB,3’非编码区的两段长度分别为391bp和721bp的序列,共发现7个SNP位点,均为转换突变。(4)SCYE1,418bp,共发现7个SNP位点,其中转换突变5个,颠换突变2个,有三个突变引起氨基酸改变。(5)SLN,615bp,包括唯一的外显子和部分5’、3’非编码区序列,发现2个SNP位点,均为转换突变。
　　 8.对基因PPP1CB的一个Rsa I多态在梅山、大白、长白和大梅F1群体中进行PCR-RFLP分型,发现只有AB和AA基因型。在梅山猪中A等位基因频率为0.96,在大白猪中A等位基因频率为0.72,在大梅猪中B等位基因频率为0.87。

目录

文摘

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课题来源

缩略词表

第一章 文献综述

1 基因差异表达与杂种优势

1.1 杂种与亲本间基因差异表达模式

1.2 基因差异表达模式与杂种优势的关系

1.3 杂交种与亲本之间差异表达基因与杂种优势及其分离

1.4 蛋白质差异与杂种优势

1.5 甲基化与杂种优势

2 基因差异表达的研究方法

2.1 消减杂交法(Subtractive Hybridization)

2.2 mRNA差异显示(mRNA Differential Display)

2.3 代表性序列差异分析(Representation Difference Analysis,RDA)

2.4 cDNA-AFLP(cDNA Amplified fragment length polymorphism)

2.5 基因表达系统分析(Serial Analysis of Gene Expression,SAGE)

2.6 抑制消减杂交(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)

2.7 cDNA微阵列(cDNA microassay)

3 研究目的与意义

第二章 材料与方法

1 主要仪器与设备

2 试剂盒、试剂、载体及菌株

2.1 试剂盒

2.2 试剂和酶

2.3 载体及菌株

3 实验样品

3.1 组织样

3.2 猪群和DNA样

4 实验方法

4.1 肌肉组织总RNA的提取

4.2 背最长肌mRNA的分离

4.3 SMART cDNA的合成

4.4 抑制消减杂交

4.5 消减文库的构建

4.6 消减cDNA文库的筛选

4.7 阳性克隆cDNA片段测序及序列分析

4.8 RT-PCR检验差异表达基因

4.9 差异基因全长cDNA克隆及序列分析

4.10 差异基因组织表达分析

4.11 差异基因的基因组结构分析和序列克隆

4.12 多态性分析和SNP研究

第三章 结果与分析

1 背最长肌组织总RNA的提取

2 抑制消减杂交

2.1 Driver cDNA和Tester cDNA的制备

2.2 消减杂交、抑制性PCR和消减效率的检测

3 消减cDNA文库的构建和筛选

3.1 消减cDNA文库的构建和PCR筛选

3.2 斑点杂交筛选

3.3 阳性克隆测序及序列分析

3.4 基因差异表达的RT-PCR验证

4 差异基因的克隆、序列分析、表达谱及部分基因组研究

4.1 MS140(PPPlCB:protein phosphatase 1,catalytic subunit,beta isoform)

4.2 MS545(signal peptidase 12 kDa subunit,SPC12)

4.3 MS138(downregulated in ovarian cancer 1,DOC1)

4.4 DM413(Eukaryotic translation initiation factor 4E,EIF4E)

4.5 DM288(small inducible cytokine subfamily E,member 1,SCYEI)

4.6 MS198(zinc finger,A20 domain containing 2,ZA20D2)

4.7 MS345(ribosomal protein L5,RPL5)

4.8 MS552(sarcolipin,SLN)

4.9 DM537(cytochrome c oxidase subunit vllc cox7c)

第四章 讨论

1 关于抑制消减杂交技术

2 差异基因的高通量筛选

3 关于半定量RT-PCR

4 EST的电子克隆与ORF序列的获取

5 关于PCR引物的设计

6 关于差异表达基因

6.1 PPP1CB(Protein phosphatase 1,catalytic subunit,beta isoform)

6.2 COX7C(Cytochrome C oxidase Ⅶc)

6.3 SLN(Sarcolipin)

6.4 RPL5(Ribosomal protein L5)

6.5 SPC12(Signal peptidase 12 kDa subunit)

6.6 EIF4E(Eukaryotic translation initiation factor 4E)

6.7 ZA20D2(Zinc finger protein,A20 domain containing 2)

6.8 DOC1(Downregulated in ovarian cancer 1)和SCYE1(Small inducible cytokine subfamily E,member 1)

7 关于猪新基因与其他物种基因组和氨基酸的保守性

8 关于SNP位点

9 关于下一步的工作

小结

参考文献

附录

用于表达分析的引物

基因克隆引物

致谢