家猫血管紧张素转换酶2基因表达、突变体构建及作为SARS-CoV受体的功能研究

摘要

2002年冬天至2003年，我国爆发严重急性呼吸综合症，并迅速传播至全球二十多个国家，导致8000多人感染，将近10％感染者死亡，一种新的冠状病毒（SARS-CoV）是这场疫情的元凶。SARS-CoV的传播与动物有关。2003年，研究人员从果子狸中分离到了SARS病毒，全基因组序列与人类SARS病毒具有99％的同源性。最近研究又发现蝙蝠携带有类SAR-CoV，与人SARS-CoV基因组序列同源性达92％，不过这种病毒不会直接感染人类。野生蝙蝠可能是非典病毒的源头宿主，果子狸只不过是SARS-CoV变异传播链上一个很重要的环节，作为SARS-CoV的中间宿主和重要载体将病毒从野外传染到人类身上。家猫也是SARS-CoV的易感动物。2003年SARS大爆发期间，在香港陶大花园SARS患者家中的宠物猫血清中检测到了SARS-CoV。SARS-CoV人工感染家猫、雪貂也获得成功，病毒能够在家猫体内正常增殖，被感染的家猫能有规律排毒，出现与人类SARS-CoV感染类似的病理变化，并可将病毒传染给与其共同饲养的原本不带毒的动物。 人的血管紧张素转换酶2（ACE2）是SARS-CoV的一个功能性受体，本实验室首次克隆了家猫ACE2基因，为了深入探讨家猫ACE2基因作为SARS-CoV受体及其在SARS传播中的作用，本研究开展了如下工作： （1）家猫ACE2空间结构建模：家猫ACE2基因编码的氨基酸序列与人ACE2同源性达85％，本研究以人ACE2结构为模板，用同源模建法建立了猫ACE2的三维空间结构模型，蛋白质对接法模拟了猫ACE2分子与SARS-CoV S的RBD结合。所预测的三维结构基本在一定程度上能反映出猫ACE2真实的空间构象，预测得到的模型与人ACE2的空间结构非常相似。比较ACE2分子中与SARS-CoV S蛋白受体结合区相接触的18个氨基酸，家猫ACE2只有三个氨基酸与人ACE2不同，分别为L24Q、E38D与T82M，提示家猫ACE2可能为SARS-CoY的功能性受体。 （2）家猫ACE2原核表达及与SARS-CoV S1蛋白的结合：人ACE2的受体功能区位于N端，SARS-CoV的受体结合蛋白为其纤突蛋白S1蛋白。为了获得家猫ACE2作为SARS-CoV受体的直接证据，本研究在大肠杆菌BL21（DE3）中表达了家猫ACE2 N端19aa-367aa，并纯化得到重组蛋白。经配体转印试验和ELISA均证实，重组的fACE2<,19～367>蛋白片段能够与重组的SARS-CoV S1蛋白结合。 （3）猫ACE2基因的真核表达：为了深入研究猫ACE2基因的受体活性，进一步构建了基因片段的真核表达载体pcDNA-mfA367，间接免疫荧光检测表明家猫ACE2 N端1aa-367aa在细胞膜上实现了定位表达。这为深入研究猫ACE2的SARS-CoV受体功能提供了重要工具。 （4）家猫ACE2突变体构建：为了进一步研究家猫ACE2在SARS～CoV跨种感染中的地位，本研究进行了家猫ACE2系列突变体构建。针对已报道的人ACE2决定SARS-CoV受体功能的关键氨基酸，以pcDNA-mfA367为模板，用定点突变技术构建了六个单位点突变体。在此基础上，对突变体进行了真核表达，进一步用假病毒感染试验、合胞体观察实验、免疫荧光等检测了猫ACE2及其突变体与SARS-CoV之间的相互作用。 总之，本研究获得猫ACE2作为SARS～CoV受体的生物信息学证据及直接的体外实验证据。构建了猫ACE2的原核与真核表达载体，获得系列ACE2的系列突变体并进行了真核表达与功能分析。为进一步研究家猫ACE2在SARS-CoV跨种感染中的作用与意义奠定了良好基础。

目录

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摘要

1文献综述

2.研究目的和意义

3.材料与方法

4结果与分析

5.讨论

参考文献

致谢