木霉β-1，3-葡聚糖酶的分离纯化、性质和部分结构研究

摘要

β-1，3-葡聚糖是一种生物活性强、毒副作用低的高效生物应答物，但目前常用的碱法提取得到的β-1，3-葡聚糖水溶性差，使其应用受到了很大限制。利用β-1，3-葡聚糖酶对β-1，3-葡聚糖进行酶解增溶，将极大地拓宽其在医药、食品及化妆品等行业中的应用。本试验以研究室分离得到的木霉菌株LE02为研究对象，采用盐析沉淀、凝胶过滤层析、离子交换层析、电泳、薄层层析、等点聚焦电泳、紫外差光谱及圆二色谱等方法对其所产β-1，3-葡聚糖酶进行分离纯化，并对该酶的酶学性质进行了研究，主要得出以下几点结论： 1、采用不同的沉淀方法分别对木霉菌株LE02所产胞外β-1，3-葡聚糖酶进行沉淀。在三种沉淀方法中，硫酸铵分段盐析法优于丙酮和乙醇沉淀。β-1，3-葡聚糖酶经30％→80％的硫酸铵分段盐析、透析浓缩后，仅用Sephadex G-200凝胶柱层析法得不到单一的酶蛋白；而直接采用DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析可得到电泳纯的酶蛋白，总酶活回收率78.71％，比酶活689.93U／mg，比粗酶液提高了53.74倍。经常规聚丙烯酰胺凝胶电泳后，分别采用考马斯亮蓝R-250染色和特异性活性染色，证实木霉菌株所产的胞外β-1，3-葡聚糖酶没有同工酶，用SDS-PAGE法测得其分子量为80.137KDa，等电聚焦电泳测得该酶的等电点为7.0。 2、β-1，3-葡聚糖酶的酶学性质研究表明，该酶的最适反应温度为55℃，最适反应pH值为5.0，在不超过50℃时热稳定性较好、pH值在4.5-6.0范围内酸碱稳定性较好。Co<'2+>、K<'+>、Zn<'2+>、Li<'+>、Ba<'2+>、Cu<'2+>、1％β-巯基乙醇对该酶基本没有影响，Cd<'2+>、10.0mmol／L的Mg<'2+>以及5mmol／L和10mmol／L的Fe<'2+>对该酶具有部分抑制作用，而0.6mol／L的尿素、低浓度的Hg<'2+>、5.0mmol／L以上的Mn<'2+>和10.0mmol／L以上的Fe<'3+>能强烈抑制该酶的活性；1.0mmol／L，DTT和0.1％SDS对该酶具有一定的激活作用。利用双倒数作图法研究Fe<'3+>和尿素对酶的作用，结果发现，Fe<'3+>对酶的作用为非竞争性抑制类型，而尿素对该酶的作用为混合型抑制类型。该酶只能作用于β-1，3-糖苷键，当以Laminarin（昆布多糖）为底物时，β-1，3-葡聚糖酶的米氏常数K<,m>值为128.34μg／mL，最大反应速度V<,m>为23.01μg／min.mL。经薄层层析进一步证明，该酶为内切β-1，3-葡聚糖酶。 3、β-1，3-葡聚糖酶的pH差光谱出现了△A245nm和△A297nm两个差光谱峰，其酪氨酸残基的表观离解常数pKa’=11.26。圆二色谱（CD）分析显示，β-1，3-葡聚糖酶是一种以β-折叠结构为主的酶蛋白。在最适pH值下，其二级结构形式中α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲的比例分别为：10.4％，55.2％，8.8％，25.6％，并通过圆二色数据还可知木霉β-1，3-葡聚糖酶是一种α／β型的蛋白质。

目录

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摘要

1前言

2材料与方法

3结果与分析

4讨论

5结论

参考文献

致谢

附录