黄鳍棘鲷rIL-1β生物学活性检测及血清IgM的纯化

摘要

本实验室于2005年克隆了黄鳍棘鲷白细胞介素1β，并将推测的成熟肽基因序列插入原核表达载体pQE30，再转化到大肠杆菌细胞M15中，构建了原核表达系统。在此基础上，开展了黄鳍棘鲷白细胞介素1β生物学活性方面的研究。 对诱导表达后的重组蛋白采用Ni<'2+>-Chelating Sepharose FF层析技术进行了纯化，并采用梯度透析对纯化蛋白进行复性。结合对插入片段的测序结果以及WesternBlot可以确定，所纯化的重组蛋白即为重组白细胞介素1β(recombinant Interleukin1β，rIL-1β)。经过Band Scan 5.0软件分析，纯化的rIL-1β纯度达到95％。纯化蛋白经过离心超滤浓缩后，Bradford法测定其浓度为0.18mg/ml；经鲎试剂检测，纯化蛋白的内毒素含量小于0.964EU/ml。 采用Percoll不连续密度梯度离心分离黄鳍棘鲷头肾白细胞，实验证明，在分离液密度1.080g/ml的界面上富集的细胞中，白细胞超过95％。将制备的头肾白细胞进行原代细胞培养，并用rIL-1β刺激培养的细胞，23℃培养4h后提取细胞的总RNA，用RT-PCR方法检测到，当培养基中rIL-1β的浓度达到20ng/ml时可以有效提高几．1β基因的转录水平，与5μg/ml LPS的刺激效果相当。 分别采用Sepharose-6B凝胶过滤层析、Phenyl Sepharose FF疏水作用层析和rProtein A Sepharose亲和层析技术纯化黄鳍棘鲷血清IgM，并对这三种层析纯化方法进行了比较。纯化产物进行SDS-PAGE，电泳结果扫描后经Band Scan5.0软件分析显示：单独使用Sepharose-6B凝胶过滤层析或Phenyl Sepharose FF疏水作用层析得到的IgM纯度只有56％；两者联合使用可以达到69％，而rProtein ASepharose亲和层析一步就可以达到89％的纯度；纯化得到的黄鳍棘鲷血清IgM的重链和轻链分子量分别为73.6KDa和26.5KDa。以rProtein A Sepharose亲和层析纯化的黄鳍棘鲷血清IgM为抗原，制备其兔的抗血清，经过间接ELISA检测，效价达到1：25600，为进一步开展rIL-1β的免疫佐剂功能的研究奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

第一章文献综述

1细胞因子与IL-1概述

1.1细胞因子的概念及分类

1.2IL-1的结构及进化

1.3IL-1的生理功能

2鱼类IL-1β的研究进展

2.1鱼类IL-1β的克隆及序列分析

2.2鱼类IL-1β的表达及调控

2.3鱼类IL-1β功能的研究

3鱼类IgM的分子结构及分离纯化

3.1鱼类IgM的分子结构

3.2鱼类IgM的分离纯化

4研究的目的意义

第二章黄鳍棘鲷rIL-1β生物学活性检测

1材料与方法

1.1实验动物与菌株

1.2实验仪器

1.3试剂及配制

1.4 rIL-1β的纯化与检测

1.5 rIL-1β的鉴定

1.6纯化蛋白浓度的测定(Bradford法)

1.7纯化蛋白内毒素含量的测定

1.8头肾白细胞的分离

1.9 β-actin及IL-1β片段的克隆与测序

1.10 RT-PCR检测rIL-1β生物学活性

2结果

2.1 rIL-1β的SDS-PAGE检测

2.2 rIL-1β的鉴定

2.3纯化蛋白的浓度

2.4纯化蛋白的内毒素含量

2.5头肾白细胞的分离

2.6 β-actin及IL-1β克隆检测结果

2.7 rIL-1β生物学活性的RT-PCR检测

3讨论

第三章黄鳍棘鲷血清IgM的纯化及兔抗血清的制备

1材料与方法

1.1实验动物

1.2实验仪器

1.3试剂及配制

1.4黄鳍棘鲷血清IgM的纯化

1.5血清IgM纯化效果的检测

1.6纯化的血清IgM浓度的测定

1.7兔抗血清的制备及检测

2结果

2.1血清IgM纯化检测

2.2纯化的血清IgM浓度

2.3兔抗血清的效价

2.4兔抗血清的纯度

3讨论

参考文献

致谢