氯霉素ELISA检测试剂盒的评价及初步改进

摘要

为了实现对氯霉素残留的免疫分析，本实验室建立了检测动物性食品中氯霉素残留的ELISA快速检测试剂盒。由于各国对氯霉素在动物性食品中的最高残留限量(MRL)的规定越来越低，对氯霉素检测试剂盒的灵敏度要求也随之提高，由此，本实验对该试剂盒中的主要试剂和反应条件进行了进一步改进，研究结果如下。 1.氯霉素全抗原及酶标记抗原的合成用化学方法合成了氯霉素半抗原的中间体，然后采用重氮化法将此中间体与人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)偶连制备了氯霉素全抗原；采用过碘酸钠法合成了酶标记抗原。氯霉素全抗原和酶标记抗原经紫外分光光度计鉴定其合成是成功的。 2.氯霉素多克隆抗体的制备购进20只日本大耳白兔，随机分为7组，前6组免疫不同的氯霉素全抗原，第7组为空白对照，经四次免疫后颈动脉放血制备了抗血清。对抗血清进行了饱和硫酸铵粗提、葡聚糖G<,200>纯化，CAP-HSA组多克隆抗体效价和灵敏度最高，效价可达5×10<'5>，灵敏度用IC50表示可达4.5μg/L。 3.氯霉素单克隆抗体的制备用氯霉素全抗原免疫Balb/c小鼠，通过常规的细胞融合技术与SP2/0骨髓瘤细胞融合；用间接ELISA和直接竞争ELISA进行双筛选，所得的阳性杂交瘤细胞株，采用有限稀释法进行了克隆，得到了4株单抗细胞株。在细胞株筛选的过程中发展了一种梯度筛选的方法，使筛选出的细胞株能够分泌高亲和力的抗体。 4.氯霉素ELISA检测方法的考核ELISA方法的灵敏度：用IC<,50>表示，变动范围在7.9μg/L～15.6μg/L之间，均值为11.6μg/L；方法的最低检测限：对标准溶液的最低检测限为0.3rig/mL，对猪肌肉、鸡肌肉中氯霉素的最低检测限分别为2.540μg/kg、1.896μg/kg；方法的准确度：当添加浓度为3.0μg/kg～10.0μg/kg时，氯霉素在猪肉中的回收率均在60％～110％之间，批间变异系数均低于20％；方法的精密度：此方法批内和批间变异系数均低于30ng/mL，符合残留检测要求；ELISA检测方法与GC方法的比较： ELISA法回收率为71.2％，低于GC法的87.6％，变异系数为6.7％，高于GC法的6.6％，但均属正常波动范围。 5.氯霉素ELISA检测试剂盒的研制试剂盒的稳定性：2℃～8℃稳定性试验及37℃加速稳定性试验证明试剂盒在4℃可保存6个月；从ELISA方法的灵敏度、准确度、精密度等方面对自制试剂盒和荷兰产的试剂盒进行了比较，结果自制试剂盒在灵敏度、准确度、精密度等方面均低于荷兰产的试剂盒；动物残留实验表明自制的试剂盒基本具有实样检测能力；对试剂盒的复核及应用结果表明：自制试剂盒具有样品前处理简单、灵敏度高、准确可靠、操作快速简便等的优点，可广泛用于相关产品中氯霉素残留的检测。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

声明

1前言

1.1氯霉素的结构特征

1.2氯霉素的作用机理

1.3氯霉素的药动力学特征

1.4氯霉素的主要危害

1.5药物残留检测的主要方法

1.5.1微生物法

1.5.2仪器分析法

1.5.3免疫分析方法(IA)

1.6国内外分析现状

1.6.1国内现状

1.6.2国外现状

1.7各国对氯霉素在动物性食品中的最高残留限量(MRL)规定

1.8人工抗原合成

1.8.1常用半抗原与载体的连接方法

1.8.2偶联比对抗体产生和亲和力的影响

1.8.3载体蛋白的选择

1.8.4偶联臂的选择

1.9单抗和多抗在药物残留检测中的比较

1.10本研究的目的及意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1主要仪器

2.1.2主要试剂

2.1.3实验动物及细胞

2.1.4主要溶液

2.2氯霉素全抗原及酶标记抗原的合成与鉴定

2.2.1 CAP中间体的合成

2.2.2氯霉素全抗原的合成与鉴定

2.2.3酶标抗原的合成与鉴定

2.3多克隆抗体的制备

2.3.1免疫原的乳化

2.3.2免疫

2.3.3抗血清的制备

2.3.4抗体产生规律监测

2.3.5各组抗血清效价及灵敏度检测

2.3.6抗血清的粗提及纯化

2.3.7纯化后抗氯霉素PcAb的灵敏度检测

2.3.8抗氯霉素PcAb特异性测定

2.4抗氯霉素单克隆抗体的制备

2.4.1免疫原的乳化

2.4.2免疫

2.4.3用于融合小鼠的选择

2.4.4 SP2/0骨髓瘤的准备

2.4.5细胞融合与培养

2.4.6阳性孔的筛选

2.4.7阳性孔的克隆(有限稀释法)

2.4.8 SP2/0瘤细胞及杂交瘤细胞染色体数的检测

2.4.9细胞的冻存与复苏

2.5氯霉素ELISA检测方法的考核

2.5.1方法的灵敏度

2.5.2方法的最低检测限

2.5.3方法的准确度

2.5.4方法的精密度

2.5.5 ELISA检测方法与GC方法比较

2.6氯霉素ELISA检测试剂盒的研制

2.6.1试剂盒的组装

2.6.2试剂盒说明

2.6.3试剂盒的稳定性

2.6.4试剂盒的考核

2.6.5试剂盒的复核

2.6.6试剂盒的应用

3 结果与分析

3.1氯霉素全抗原及酶标记抗原的合成

3.1.1氯霉素全抗原的合成与鉴定

3.1.2 CAP-OVA-HRP的合成

3.2抗氯霉素多克隆抗体的制备

3.2.1抗血清的产生规律

3.2.2各组抗血清效价及灵敏度检测

3.2.3纯化后抗氯霉素PcAb的灵敏度检测

3.2.4 CAP-HSA组抗体PcAb特异性测定

3.3抗氯霉素单克隆抗体的制备

3.3.1融合鼠的选择

3.3.2细胞融合结果

3.3.3 SP2/0瘤细胞及杂交瘤细胞染色体数的检测

3.3.4筛选出的单克隆细胞株

3.3.5杂交瘤细胞株冻存后的复苏情况

3.4 ELISA检测方法考核

3.4.1方法的灵敏度

3.4.2方法的最低检测限

3.4.3方法的准确度

3.4.4方法的精密度

3.4.5 ELISA检测方法与GC方法的比较

3.5氯霉素ELISA检测试剂盒的研制

3.5.1试剂盒的稳定性

3.5.2试剂盒的考核

3.5.3试剂盒复核结果及分析

3.5.4试剂盒的应用

4 讨论

4.1氯霉素全抗原及酶标记抗原的合成

4.1.1 CAP中间体的合成

4.1.2氯霉素全抗原的合成

4.1.3酶标记抗原的合成

4.2多克隆抗体的制备

4.2.1免疫程序及对抗体产生的影响

4.3单克隆抗体的制备

4.3.1关于饲养细胞

4.3.2融合剂的选择

4.3.3细胞融合

4.3.4杂交瘤细胞的筛选

4.3.5两步法筛选单抗

4.3.6杂交瘤细胞的克隆

4.3.7杂交瘤细胞的冻存和复苏

4.3.8污染的控制及处理

4.4关于酶联免疫吸附测定法

4.5 ELISA方法的考核

4.6样品处理

4.7 ELISA试剂盒标准曲线标准点的设置

5结论

参考文献

致谢