鹅肝脏差异表达基因的分离和鉴定暨茶多酚对朗德鹅肥肝抗氧化性能影响的研究

摘要

超饲养(Overfeeding)引起鹅肝脏代谢发生改变,使得大量脂肪沉积在肝脏中形成肥肝(fatty liver)。不同品种鹅对超饲养导致的肝脏代谢改变的敏感程度不同,所以肥肝性能差异很大。但目前鹅肥肝形成的分子机理仍然不清楚。本研究以朗德鹅和溆浦鹅为试验材料,利用mRNA差异显示技术和荧光定量PCR技术,对两个品种之间、肥肝和普通肝脏之间差异表达基因进行了分离和鉴定,并通过生物信息学方法从蛋白质和核酸两个水平上进行了结构与功能预测,取得了如下研究结果:
　　 实验使用了90对差异显示引物来研究两个品种鹅肥肝和普通肝脏中mRNA表达水平对超饲养的反应情况,并用荧光定量PCR进行了验证。6个基因被证实在肥肝和普通肝脏之间差异表达,其中3个基因表达水平被上调,2个基因被下调,1个基因在两个品种试验鹅中表现了相反的调控状态。
　　 基因8216的表达水平在肥肝中被上调了,并且朗德鹅肝脏(LL和LFL)中的表达水平高于溆浦鹅(XpL和XpFL,)。这个基因的全长cDNA是1797bp,GenBank登陆号:EF488993,经过比对,这个基因的全长cDNA序列与鸡硒结合蛋白1(selenium binding protein1,SELENBP1；XM_423397.2)基因有92％的同源性。序列分析发现,这个cDNA序列含有一个1413bp的开放读码框(ORF),编码一个471个氨基酸的蛋白质。这个蛋白质中含有一个56 kDa的硒结合蛋白(SBP56)保守结构域。聚类分析表明,该蛋白质与鸡、大鼠、人、猴、狗、牛、小鼠的SBP56蛋白分别具有95％、86％、86％、86％、86％、86％、84％的同源性。组织表达分析显示,鹅基因8216在肝脏和肾脏中表达丰富,在脾脏中中等表达,在卵巢、子宫、肌胃和腹脂中表达量较低。
　　 基因9105的表达水平在肥肝中被上调了。经过cDNA克隆,得到一个包含全长CDS的1248bp的cDNA片段,GenBank登陆号:EF541127。比对的结果表明,该片段与鸡的转化生长因子β-2 mRNA(transforming growth factor beta2,TGFB2；NM001031045.1)有94％的同源性,与其它物种的TGFB2也有很高的同源性。序列分析发现,这个cDNA序列含有一个1239bp的开放读码框架(ORF),编码一个有412个氨基酸的蛋白质。BlastP分析表明,该蛋白质序列存在着2个保守的功能域,一个是引导序列(TGFb前肽),另一个是功能结构域(TGFβ)。聚类分析表明,该蛋白质与鸡、非洲爪蛙、大鼠、人、短尾猊、牛、小鼠、猪、绵羊的TGFb2蛋白分别具有99％、96％、87％、90％、91％、89％、88％、90％、89％的同源性。组织表达分析显示,鹅基因9105在肌胃中表达很丰富,在肝脏、脾脏和卵巢中表达也较丰富,在子宫、肺和肌肉中中等表达,而在肾脏和腹脂中表达量较低。
　　 基因7501的表达水平在肥肝中被上调了,肥肝中(LFL和XpFL,)高于普通肝脏(LL和XpL),朗德鹅(LL和LFL)高于溆浦鹅(XpL和XpFL)。经过cDNA克隆,得到一个1446bp的cDNA片段。经过比对,这个基因的部分cDNA序列与鸡的细胞质NADP(+)-依赖型苹果酸酶1mRNA(malic enzyme1。NADP(+)-dependent,cytosolic,ME1；NM_204303.1)有93％的同源性,与其它物种的ME1也有很高的同源性。组织表达分析显示,鹅基因7501在肝脏中表达很丰富,在脾脏、卵巢、子宫、肺、肾脏、肌胃和肌肉中中等表达,而在腹脂中表达量最低。
　　 基因8407的表达水平在肥肝中被下调了。经过cDNA克隆,得到一个包含全长CDS的1269bp的cDNA片段,GenBank登陆号:EF541128。比对的结果表明,该片段与鸡的细胞质异柠檬酸脱氢酶mRNA(cytosolic NADP-dependent isocitratedehydrogenase,IDH1；XM_421965)有95％的同源性,与其它物种的IDH1也有很高的同源性。序列分析发现,这个cDNA序列含有一个1248bp的开放读码框架(ORF),编码一个有415个氨基酸的蛋白质。BlastP分析表明,该蛋白质序列存在着一个保守的结构域,这个结构域与已知的真核蛋白Icd具有较高的同源性。聚类分析表明,该蛋白质与鸡、大鼠、人、猿、牛、小鼠的Icd蛋白分别具有99％、89％、90％、90％、88％、88％的同源性。组织表达分析显示,鹅基因8407在肝脏中表达丰富,在脾脏、肾脏和肌胃中中等表达,在卵巢、子宫、肺、肌肉和腹脂中表达量较低。
　　 基因9302的表达水平在肥肝中被下调了。经过cDNA克隆,得到一个943bp的cDNA片段。经过比对,这个基因的部分cDNA序列与鸡的胆固醇-7α羟化酶基因(Cytochrome P450,family7,subfamily A,polypeptide1,CYP7A1；XM_419217)有93％的同源性。组织表达分析显示,鹅基因9302在肝脏中表达很丰富,在其它组织中不表达。
　　 基因7102的表达水平在两种鹅中表现了相反的调控状态,朗德鹅肥肝中基因7102的表达水平被上调了,而在溆浦鹅肥肝中被下调了。经过cDNA克隆,得到一个923bp的cDNA片段。经过比对,这个基因的部分cDNA序列与鸡的NAD依赖型苹果酸脱氢酶基因(malate dehydrogenase1,NAD(soluble),mRNA,MDH1；NM_001006395.1)有95％的同源性,与其它物种的MDH1基因也有很高的同源性。组织表达分析显示,鹅基因7102在肝脏中表达很丰富,在其它组织中表达量较低。

目录

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课题来源

缩略词表

第一部分 鹅肝脏差异表达基因的分离和鉴定

1 文献综述

1.1 动物数量性状的分子基础

1.2 基因差异表达的研究方法

1.3 mRNA差异显示技术及差异表达基因验证的方法

1.4 获取全长cDNA的方法

1.5 反转录实时定量PCR(real-time quantitative RT-PCR)技术

1.6 生物信息学的发展和应用

1.7 鹅肥肝形成机制的研究进展

2 研究的目的和意义

3 材料与方法

3.1 实验材料

3.2 实验方法

4 结果与分析

4.1 总RNA及反转录cDNA模板的检测

4.2 鹅肝脏差异表达基因的分离

4.3 基因8216的克隆、鉴定、序列分析和组织表达特征分析

4.4 基因8407的克隆、鉴定、序列分析和组织表达特征分析

4.5 基因9105的克隆、鉴定、序列分析和组织表达特征分析

4.6 基因9302的克隆、鉴定、序列分析和组织表达特征分析

4.7 基因7501的克隆、鉴定、序列分析和组织表达特征分析

4.8 基因7102的克隆、鉴定、序列分析和组织表达特征分析

5 讨论

5.1 关于总RNA的质量

5.2 差异表达基因的确定和鉴定

5.3 超饲养诱导的表达水平上升的基因

5.4 超饲养诱导的表达水平下降的基因

5.5 关于MDH1基因

6 小结

6.1 试验获得的结果

6.2 本研究的创新点与特色

6.3 本研究的不足

6.4 由本研究引出的问题

第二部分 茶多酚对超饲养朗德鹅脂肪代谢及肝脏抗氧化性能影响的研究

1 文献综述

1.1 茶多酚生物抗氧化作用的研究进展

1.2 茶多酚对动物脂肪代谢影响的研究进展

1.3 超饲养鹅脂肪代谢特点

2 本研究的目的和意义

3 材料与方法

3.1 试验动物的饲养和日粮的准备

3.2 样品的准备

3.3 其它指标的测定

3.4 血清样品中生化指标的分析

3.5 肝脏样品中酶和丙二醛的测定

3.6 实验数据统计分析

4 结果与分析

4.1 产肝性能和屠宰性能

4.2 血清生化指标

4.3 肝脏抗氧化指标

4.4 相关性分析

5 讨论

5.1 日粮中茶多酚对试验鹅产肝性能和脂肪代谢的影响

5.2 日粮中茶多酚对试验鹅机体抗氧化性能的影响

6 小结

6.1 已经获得的结果

6.2 本研究的创新点与特色

6.3 本研究的不足

参考文献

附录

致谢