紫云英共生固氮相关基因在铵胁迫及盐胁迫下的表达研究

摘要

根瘤菌在豆科植物根部通过共生作用形成根瘤。根瘤将空气中的氮气固定，转化为有机氮供植物吸收。已有研究表明：多种环境胁迫因素会抑制共生固氮过程。本研究对接种了华癸中生根瘤菌的盆栽紫云英进行了铵胁迫和盐胁迫处理。以研究其固氮效应和紫云英中若干基因在胁迫下的表达变化。 在此研究之前，本实验室已通过抑制差减杂交法从紫云英中分离出14条根瘤中特异表达或增强表达的基因全长序列。本研究对其中5个紫云英根瘤特异表达基因在铵胁迫和盐胁迫下的表达特征进行了研究。用实时荧光定量PCR法对基因转录水平进行了定量。结果是： (1)在所有含硫酸铵的胁迫处理及80mM氯化钠胁迫下，结瘤的紫云英固氮活性都被显著抑制，40mM氯化钠胁迫下被轻微抑制； (2)与无胁迫处理的正对照相比，5个被检基因的表达在铵胁迫下被显著抑制； (3)在不添加额外氮源的氯化钠胁迫下，基因AsIIA255和AsE246的转录量在胁迫3天后显著提高，AsG2411、AsIIC2512 和 AsB2510 在 80mM 氯化钠胁迫下被显著抑制，40mM则无显著影响； (4)在添加额外氮源的氯化钠胁迫下，AsG2411、AsIIC2512、AsB2510和 AsIIA255转录量被显著抑制，而在添加氮源的80mM 氯化钠胁迫下，AsE246基因的表达水平仍然与无胁迫对照中的水平相当。 结果表明：本研究中的3个半胱氨酸家族蛋白基因(AsG2411，AsIIC2512，AsIIA255)和1个脂转移蛋白基因(AsE246)的表达与根瘤固氮活性有关，而此前对该类基因在共生固氮中的作用主要报导为参与根瘤的防御功能。AsIIA255 和 AsE246还可能参与了紫云英在共生固氮中对盐胁迫的应答机制。 除以上工作外，还用RT-PCR法克隆了与紫云英共生固氮有关的3条基因的全序列，分别是： (1)紫云英共生受体激酶基因(SYMRK)，该基因与植物感受根瘤菌分泌的结瘤因子有关； (2)紫云英磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(AsPEPC)，该基因在根瘤中增强表达，与根瘤中的四碳二羧酸代谢有关； (3)二磷酸核苷酸磷酸酶基因(AsPPD)，该基因在根瘤中特异表达。

目录

文摘

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论文说明：缩略语表

声明

第一章文献综述

1共生固氮的概念和意义

1.1微生物固氮的三种方式

1.2根瘤菌与豆科植物的相互作用过程

1.3根瘤菌中参与共生固氮的基因

2豆科植物中参与共生固氮的基因

2.1参与宿主植物与根瘤菌相互识别的植物基因

2.2参与根瘤形成、发育的基因

2.3与固氮等氮代谢有关的基因

2.4与共生固氮相关的其他基因

3共生固氮与自然环境的相互影响及作用

3.1共生固氮对自然界生态平衡及农业生产的意义

3.2影响共生固氮体系的环境因素

3.3盐胁迫对植物的生理影响及植物的应对机理

4本研究室对紫云英中共生固氮相关基因的研究工作

5实时荧光定量PCR技术原理及应用

5.1实时荧光定量PCR技术的原理简介

5.2实时荧光定量PCR技术的相关参数

5.3几种主要的荧光定量PCR技术

5.4实时荧光定量PCR的参照物

5.5荧光定量RT-PCR反应系统实验设计原则

5.6荧光定量PCR的应用

5.7发展趋势及应用前景

5.8本论文拟开展的研究内容和意义

第二章材料和方法

1材料

1.1植物及微生物材料

1.2营养液与培养基配方

1.3胁迫处理用的无机盐母液

1.4常用贮存液和缓冲液配方*

1.5主要分子生物学试剂

1.6主要耗材

1.7主要仪器设备

1.8引物合成及测序

2方法

2.1盆栽紫云英

2.2胁迫处理

2.3盆栽植株的共生固氮效应检测

2.4提取RNA

2.5 Real-time PCR检测根瘤特异表达基因在胁迫下的表达特征

2.6对紫云英中若干共生固氮相关基因的克隆

2.7 PCR产物的克隆与测序

第三章结果与分析

1紫云英在铵胁迫及盐胁迫下的共生固氮性状

1.1各对照组的共生固氮效应分析

1.2铵胁迫对共生固氮效应的影响

1.3盐胁迫对共生固氮效应的影响

1.4小结

2铵胁迫和盐胁迫对紫云英共生固氮相关基因表达的影响

2.1紫云英植株RNA样品的提取

2.2 RNA样品的纯化和浓度调整

2.3对Real-time PCR引物的验证

2.4各样品RNA浓度的调整

2.5豆血红蛋白基因AsB2510在胁迫处理下的表达特征

2.6两个半胱氨酸蛋白(CCP)家族基因AsG2411和AsIIC2512在胁迫处理下的表达特征

2.7转脂质蛋白(LTP)基因AsE246在胁迫处理下的表达特征

2.8与结瘤素基因Nod3同源的AsIIA255在胁迫处理下的表达特征

2.9小结

3对紫云英中若干共生固氮相关基因的克隆

3.1对紫云英共生受体激酶基因的克隆

3.2对根瘤增强表达的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆

3.3对根瘤增强表达的二磷酸核苷酸磷酸酶基因的克隆

3.4小结

第四章讨论

1对铵胁迫及盐胁迫实验的讨论

2对克隆的紫云英根瘤增强表达基因的讨论

3要进一步进行的工作

参考文献

致谢

论文发表情况