支气管败血波氏杆菌的重组沙门氏菌基因工程疫苗研究

摘要

支气管败血波氏杆菌(Bordetellabronchiseptica,Bb)可引起猪发生肺炎和萎缩性鼻炎(Atrophicrhinitis，AR)，也是猪呼吸道疾病综合征(porcinerespiratorydiseasecomplex，PRDC)的重要致病因子之一。更重要的是，Bb的先期感染易于导致其它多种病原的继发感染，从而增加猪群呼吸道疾病的发病率和严重程度，造成严重经济损失。以AR为代表的猪波氏菌病现已遍布养猪业发达国家，已成为猪的重要呼吸道传染病之一。本研究对Bb的病原流行病学、生物学特性、免疫原性基因、诊断方法和重组沙门氏菌基因工程疫苗进行研究，为我国Bb的流行病学分布提供理论依据，为猪波氏菌病的临床诊断、预防与控制提供新方法。主要研究内容如下： 1.Bb的分离鉴定与病原流行病学研究 从全国十五个省市送检的2,057份有肺炎或AR症状猪的肺脏等病料组织中分离出190株Bb和不同数量的共感染菌。2003～2006年间的Bb总分离率为9.2％；不同省份Bb的总分离率介于7.5～14.1％之间；不同年份Bb的总分离率介于7.3～11.8％之间；Bb的分离率与猪日龄有一定关系。Bb最常见的共感染菌依次是链球菌(55.9％)、副猪嗜血杆菌(50.0％)、大肠杆菌(43.1％)、巴氏杆菌(25.5％)和绿脓杆菌(17.6％)。在43份有典型AR症状猪的病料中，分离出22株Bb、7株产毒素巴氏杆菌和6株绿脓杆菌；在分离出产毒素巴氏杆菌的7份病料中均同时分离出Bb，而其中6份又同时分离出绿脓杆菌。研究结果表明，Bb在我国猪群的感染十分普遍，Bb与其它病原菌的共感染情况非常严重，且在AR的发生中具有重要作用。 2.Bb的生长特性及强毒菌株的筛选 Bb在多种培养基中均生长良好，但加血液的鲍-姜氏培养基更易于BbI相菌形态的维持，且在含绵羊血的鲍-姜氏培养基上产生更明显的β-溶血环。小鼠致死性试验结果表明Bb毒力普遍较弱，但少数菌株如1562、3331、HH0809等表现出很强的毒力。以HH0809株为出发菌株分别建立小鼠和仔猪的呼吸道感染模型。采用建立的感染模型测定HH0809株对小鼠的LD50(the50％lethaldose)为1.4×105CFU，对猪的LD50为2.0×1010CFU，详细记录了感染小鼠和感染仔猪的症状和病理变化。Bb生长特性研究以及小鼠和仔猪的呼吸道感染模型的建立为猪波氏菌病快速诊断试剂及高效疫苗的研制、开发奠定基础。 3.Bb保护性抗原基因的筛选 以强毒菌株HH0809的基因组为模板，分段克隆表达Bb重要的保护性抗原丝状血凝素基因fhaB(6,260bp)和百日咳杆菌粘附素基因prn(2040bp)。fhaB基因分为5段，从N端到C端分别命名为F5(1,400bp)、F4(1,200bp)、F3(1,200bp)、F2(1,800bp)和F1(660bp)；prn基因分为2段，从N端到C端分别命名为P1(1,190bp)和P2(850bp)，以及prn基因全段(2,040bp)；将8段DNA片段分别克隆到pGEX-KG表达载体并在大肠杆菌BL21中进行诱导表达，纯化包涵体后使用30μg(与等体积弗氏完全佐剂混合)免疫BALB/c小鼠，于21d后使用4×LD50的Bb强毒株HH0809进行呼吸道的气雾攻毒。结果表明：fhaB基因各片段表达产物GST-F1、GST-F2、GST-F3、GST-F4和GST-F5免疫组小鼠的存活率分别为66.7％(6/9)、0(0/9)、0(0/9)、44.4％(4/9)和11.1％(1/9)：prn基因各片段表达产物GST-P1、GST-P2和GST-PRN免疫组小鼠的存活率分别为88.9％(8/9)、100％(9/9)和100％(9/9)。小鼠保护力试验结果证实FHA和PRN均是Bb重要的保护性抗原成分。其中，FHA的C端F1片段(TypeIdomain)和PRN的P2段(RegionIIdomain)分别为两种抗原最重要的免疫保护性抗原区域，有望作为波氏菌病的诊断抗原和新型疫苗的成分。 4.Bb抗体检测ELISA方法的建立与应用 利用已纯化的各段表达蛋白GST-F5、GST-F4、GST-F3、GST-F2、GST-F1、GST-P1、GST-P2和GST-PRN分别进行间接ELISA检测方法研究。结果显示，作为包被抗原，GST-PRN优于其它各段蛋白。进一步通过凝血酶Thrombin酶切GST-PRN并回收，获得纯的不含GST载体蛋白的PRN蛋白片段。以PRN蛋白片段为抗原建立检测PRN抗体的间接EIASA检测方法。结果表明，PRN-ELISA方法特异性良好，该方法对猪巴氏杆菌病等7种常见细菌性疾病阳性血清的检测结果均为阴性；ELISA方法能够检测到人工感染仔猪14d的血清抗体IgG，比乳胶凝集方法高4～128倍，但与其符合率为100％；用该ELISA方法检测2005～2007年间来自全国各地的1,229份猪血清样本，阳性率为32.7％。该方法对2个阳性猪场的检测结果表明保育期仔猪的合群导致猪群大量感染Bb。 5.表达Bb保护性抗原的重组沙门氏菌株的构建及生物学特性 将fhaBF1段和prnP2段依次与pMD18-T载体连接，然后将F1-P2融合片段转移连入沙门氏菌asd平衡表达质粒pYA3493中，制备重组平衡表达质粒pYA-F1P2。将pYA-F1P2和pYA3493分别电转化猪霍乱沙门氏菌C500的asd缺失株C501中，制备重组菌株C501(pYA-F1P2)和空载体菌株C501(pYA3493)。研究结果表明，重组菌株C501(pYA-F1P2)保留了亲本菌株C500的生化特性和抗原表型，能稳定遗传并高效分泌表达Bb的rF1P2抗原；C501(pYA-F1P2)的毒力较亲本菌C500降低了4.5倍。将C501(pYA-F1P2)分别高剂量接种仔猪和怀孕母猪观察其作为重组疫苗的安全性。结果表明，该重组菌株和亲本菌株C500接种的仔猪均没有异常临床表现；该重组菌株和亲本菌株C500接种的怀孕母猪也没有异常临床表现，与没做任何处理的对照组怀孕母猪所产仔数没有差异。猪霍乱沙门氏菌C500弱毒株是我国广泛使用的预防仔猪副伤寒的标准疫苗株。本研究利用猪霍乱沙门氏菌C500弱毒疫苗株的asd基因缺失株构建平衡载体表达系统菌株C501(pYA-F1P2)能高效分泌表达Bb免疫原性重组抗原蛋白；该活疫苗株C501(pYA-F1P2)的毒力较亲本菌株C500稍低，对断奶仔猪和怀孕母猪均是安全的，有望成为新型猪波氏菌病-副伤寒二价活疫苗的候选菌株。 6.支气管败血波氏杆菌的重组沙门氏菌基因工程疫苗研究 利用表达Bb免疫原性基因F1(fhaB的TypeI)片段和prn基因的P2(prn的Region2)片段重组猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C501(pYA-F1P2)，制备支气管败血波氏杆菌重组沙门氏菌基因工程疫苗，检验该重组活疫苗对免疫BALB/c小鼠和猪针对猪霍乱沙门氏菌和Bb攻击的保护效力。将2.1×109CFU和2.1×108CFU重组菌株C501(pYA-F1P2)分别通过口服和皮下注射途径免疫BALB/c小鼠，结果显示两种免疫方法均能产生较高水平的血清IgG，并保护小鼠抵抗10×LD50猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-1的口服攻击(4/4)。但使用4×LD50Bb强毒株HH0809进行呼吸道气雾攻毒后，口服免疫不能提供有效保护(4/22)，而皮下免疫能够提供完全保护(22/22)。进一步检测结果表明，皮下免疫能产生较高水平的肺脏IgG，口服免疫则不能。同时，皮下免疫重组蛋白HIS-F1P2的小鼠也能完全抵抗4×LD50Bb强毒株HH0809的攻击。将1.2×1010CFU重组菌株C501(pYA-F1P2)通过颈部肌肉注射免疫20日龄仔猪，结果显示免疫仔猪能产生较高水平的针对沙门氏菌和Bb重组蛋白rF1P2的血清IgG，并能抵抗5×LD(Lethaldose)猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-1的口服攻击(4/4)。同时，免疫仔猪也能抵抗4×LD50Bb强毒株HH0809呼吸道途径的攻击(4/4)，而PBS组(0/4)和C501(pYA3493)载体对照组(1/4)均不能提供有效保护。另外，重组菌株C501(pYA-F1P2)组诱导仔猪抵抗Bb攻击的保护力优于重组蛋白HIS-F1P2。该研究构建的支气管败血波氏杆菌重组沙门氏菌基因工程疫苗菌株C501(pYA-F1P2)能保护免疫仔猪完全抵抗猪霍乱沙门氏菌和Bb的致死性攻击，有望成为实用有效的新型双价基因工程活疫苗。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词(Abbreviation)

声明

第1章文献综述

1.1波氏菌病研究进展

1.2沙门氏菌疫苗及载体研究进展

1.3总结与展望

第2章支气管败血波氏杆菌的分离鉴定与流行病学研究

2.1实验材料

2.1.1细菌菌种

2.1.2病料来源

2.1.3载体与质粒

2.1.4主要试剂、培养基与试剂盒

2.1.5主要培养基的配制

2.1.6主要溶液的配制

2.1.7主要实验器材

2.2实验方法

2.2.1病原菌的分离

2.2.2革兰氏染色镜检

2.2.3 PCR检测

2.2.3 PCR序列测定

2.3结果与分析

2.3.1 Bb的分离鉴定及分析结果

2.3.3 Bb共感染菌的分离鉴定及分析结果

2.3.4 Bb共感染菌T+Pm的分离鉴定及分析结果

2.4讨论

2.4.1 Bb的分离与鉴定方法

2.4.2 Bb与其它细菌的混合感染

2.4.3 Bb在AR形成中的作用分析

第3章支气管败血波氏杆菌的生物学特性及强毒株的筛选

3.1实验材料

3.1.1细菌菌种

3.1.2实验动物

3.1.3主要试剂和培养基

3.1.4主要培养基的配制

3.1.5主要实验器材

3.2实验方法

3.2.1 Bb的生长培养特性

3.2.2 Bb的小鼠毒力试验和强毒株筛选

3.2.3 Bb小鼠气雾攻毒感染模型的建立

3.2.4 Bb对猪的感染特性

3.3结果与分析

3.3.1 Bb的生长培养特性

3.3.2 Bb强毒株的筛选

3.3.3 Bb小鼠气雾攻毒模型的建立

3.3.4 Bb对猪的感染特性

3.4讨论

第4章支气管败血波氏杆菌的保护性抗原研究

4.1实验材料

4.1.1细菌菌种、质粒和血清

4.1.2实验动物

4.1.3主要培养基和试剂

4.1.4主要溶液的配制

4.2实验技术

4.2.1 PCR扩增

4.2.2 PCR或酶切产物的回收与纯化

4.2.3大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)

4.2.4连接产物的转化

4.2.5大肠杆菌原核诱导表达

4.2.6包涵体提取、纯化与复性

4.2.7 SDS-PAGE蛋白凝胶电泳

4.2.8表达产物的Western blot检测

4.2.9 ELISA操作

4.3实验方案

4.3.1fhaB和prn基因片段的克隆

4.3.2重组表达质粒的构建及序列测定

4.3.3基因片段的表达及表达产物的纯化

4.3.4各表达产物的小鼠免疫保护力试验

4.3结果与分析

4.3.1 FHA和PRN蛋白的序列分析

4.3.2fhaB和prn基因片段的克隆和表达载体的构建

4.3.3fhaB和prn基因片段的表达和纯化

4.3.4小鼠的抗体水平检测结果

4.3.5小鼠的免疫效力试验

4.4讨论

第5章支气管败血波氏杆菌抗体检测间接ELISA方法的建立与应用

5.1实验材料

5.1.1试验用血清

5.1.2主要药品与试剂盒

5.1.3主要溶液的配制

5.2实验方法

5.2.1 GST-PRN的表达及GST载体蛋白的去除

5.2.2 ELISA的操作步骤

5.2.3间接ELISA最佳反应条件的选择

5.2.4确定结果判定标准

5.2.5分析特异性试验

5.2.6敏感性试验

5.2.7重复性试验和方法比较试验

5.2.8 ELISA诊断方法的临床应用

5.3结果与分析

5.3.1 ELISA检测方法的初步建立

5.3.2 ELISA检测方法的初步建立

5.3.3重复性试验

5.3.4分析特异性试验

5.3.5敏感性试验

5.3.6符合率试验

5.3.7 ELISA方法的临床初步应用

5.4讨论

第6章表达Bb保护性抗原的重组猪霍乱沙门氏菌株的构建及生物学特性研究

6.1实验材料

6.1.1菌种和质粒

6.1.2实验动物

6.1.3主要试剂、药品与试剂盒

6.1.4主要培养基的配制

6.1.5主要实验器材

6.2实验技术

6.2.1 PCR或酶切产物的回收与纯化

6.2.2大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)

6.2.3连接产物的转化

6.2.4质粒的小量制备

6.2.5沙门氏菌电转化感受态细胞的制备

6.2.6沙门氏菌的电转化

6.3试验方案

6.3.1 HIS-F1P2在大肠杆菌中的表达及其抗血清的制备

6.3.2重组表达质粒pYA-F1P2的构建

6.3.3重组疫苗菌株C501(pYA-F1P2)的构建与鉴定

6.3.4重组菌株C501(pYA-F1P2)的表型鉴定

6.3.5重组菌株C501(pYA-F1P2)的遗传稳定性

6.3.6重组菌株C500(pYA-F1P2)的分泌表达

6.3.7重组菌株C501(pYA-F1P2)对小鼠的毒力试验

6.3.8重组菌株C501(pYA-F1P2)对猪的安全性评价

6.4结果与分析

6.4.1重组表达质粒pYA-F1P2的构建

6.4.2重组菌株C501(pYA-F1P2)的构建与鉴定

6.4.3重组菌株C501(pYA-F1P2)的表型鉴定

6.4.4重组菌株C501(pYA-F1P2)的生长特性

6.4.5重组菌株C501C500(pYA-F1P2)的遗传稳定性

6.4.6重组菌株C501(pYA-F1P2)的分泌表达

6.4.7 C501(pYA-F1P2)重组菌株疫苗的毒力测定

6.4.8重组菌株对猪的安全性评价

6.5讨论

第7章支气管败血波氏杆菌的重组沙门氏菌疫苗研究

7.1实验材料

7.1.1菌种和质粒

7.1.2实验动物

7.1.3主要试剂、药品与试剂盒

7.1.4主要培养基的配制

7.1.5主要实验器材

7.2实验技术

7.2.1相关试剂

7.2.2 ELISA操作

7.3试验方案

7.3.1疫苗制备

7.3.2小鼠的免疫

7.3.3小鼠抗体的ELISA检测方法

7.3.4免疫小鼠的沙门氏菌攻毒

7.3.5免疫小鼠的Bb攻毒

7.3.6仔猪的免疫程序

7.3.7免疫仔猪的沙门氏菌攻毒

7.3.8免疫仔猪的Bb攻毒

7.4结果与分析

7.4.1免疫小鼠的沙门氏菌抗体检测

7.4.2免疫小鼠针对沙门氏菌感染的保护力

7.4.3免疫小鼠的rF1P2血清抗体检测

7.4.4免疫小鼠针对Bb感染的保护力

7.4.5免疫小鼠的rF1P2肺脏抗体检测

7.4.6免疫仔猪的沙门氏菌抗体检测

7.4.7免疫仔猪针对沙门氏菌感染的保护力

7.4.8免疫仔猪的rF1P2血清抗体检测

7.4.9免疫仔猪针对Bb感染的保护力

7.5讨论

第8章结论

参考文献

附件

致谢