生长抑素基因工程天然及免疫鼠源单链抗体库构建研究

摘要

噬菌体抗体库技术是继单克隆抗体制备技术后具有换代地位的抗体制备技术，在功能蛋白的表达、疾病诊断和治疗等领域具有广泛的应用前景。生长抑素(SS)是由下丘脑分泌的一种神经多肽，通过抑制生长激素释放而抑制动物生长和泌乳，是重要的内分泌激素。因此，建立SS免疫测定方法和免疫芯片技术对于研究动物生长和泌乳调控机制、开发促进动物生长发育和泌乳的新技术等，均具有重要意义。迄今，国内外关于小分子单链抗体的研究鲜见报道，至今无应用噬菌体展示技术筛选生长抑素单链重组抗体的报道。 本研究取健康BALB/C小鼠脾脏和用偶联牛血清白蛋白的SS免疫小鼠脾脏，分别提取总RNA，扩增抗体轻链和重链可变区基因，组装成单链抗体基因。借助噬菌体展示技术，平行建立天然和免疫鼠源单链抗体库。主要结果如下： 1.人工抗原的合成及免疫：将设计合成的生长抑素利用碳化二亚胺法与BSA偶联，制备人工抗原，免疫BalB/C小鼠，其抗血清效价最高可达1:2560。 2.抗体可变区基因的获得及目的基因构建：分别取未免疫的和抗血清效价较高的小鼠脾脏提取总RNA，用RT-PCR分别扩增得到抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因，大小分别为360bp和340bp左右；纯化回收的VH与VL基因在接近等摩尔浓度下连接。在免疫库构建中采用含有Linker接头片段的引物，利用重叠延伸PCR法(SOE-PCR)将VH与VL基因片段拼接起来，再用带有限制性内切酶位点的引物扩增出单链抗体(ScFv)基因片段；在天然库构建中采用不对称PCR连接单链抗体(ScFv)基因片段，分别获得大小约750bp的目的片段。结果表明，不对称PCR连接方法的效率高于传统的组装方法。 3.ScFv噬菌体抗体库构建：ScFv基因纯化后经SfiI和NotI双酶切，与同样经过双酶切的载体pCANTAB5E连接，电穿孔法转化大肠杆菌TG1感受态细胞，提取质粒，经PCR初步鉴定证明有外源片段插入且与目的片段一致。转化菌经辅助噬菌体M13K07超感染后，收集上清，得到噬菌体抗体库。天然库的构建中，经过40次电击，获得了9.8×107抗体库，相对于免疫抗体库的3条片段SOE连接法，5次电击获得的9.3×107抗体库，后者的效率要高的多。可以看出，免疫抗体库构建的工作量远远低于天然库。 该抗体库的建立，为进一步筛选和表达抗体、建立生长抑素放射免疫测定、酶免疫测定、免疫组化分析和免疫芯片等技术奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词(Abbreviation)

声明

1.文献综述

1.1.抗体技术的发展

1.1.1多克隆抗体

1.1.2单克隆抗体

1.1.3基因工程抗体

1.2.抗体的基本结构

1.3.噬菌体展示技术

1.3.1噬菌体展示技术的基本原理

1.3.2噬菌体展示系统的发展

1.4.噬菌体抗体库的类型

1.4.1天然抗体库(Natural library)

1.4.2免疫抗体库(Immunized library)

1.4.3化学合成抗体库(Synthetic library)

1.4.4 ScFv抗体库(Single chain variable fragments antibody library)

1.4.5 Fab抗体库(Antigen binding fragments antibody library)

1.4.6双体抗体库和双特异性抗体库(Diabody library)

1.4.7二硫键稳定型抗体库(Disulfide stablilized Fv fragments antibody library)

1.5.噬菌体抗体技术的操作

1.5.1抗体可变区的获得

1.5.2噬菌体抗体库载体的构建

1.6单链抗体的表达

1.6.1原核表达

1.6.2真核表达

1.6.3噬菌体表达

1.6.4转基因动植物

1.7单链抗体的应用

1.7.1基础理论方面的研究

1.7.2中和病毒

1.7.3在肿瘤免疫诊断和免疫治疗上的应用

1.7.4细胞内免疫

1.7.5免疫毒素

1.7.6在农兽药等小分子残留检测中的应用

1.7.7构建其它类型的基因工程抗体

1.8.噬菌体抗体库的筛选

1.8.1.抗体库的经典筛选法

1.8.2.非纯化抗原进行筛选

1.9.生长抑素及小分子酶联免疫分析

1.9.1生长抑素

1.9.2小分子酶联免疫分析(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)

实验研究:1.引言

实验研究:2.材料和方法

2.1.试验材料

2.1.1噬菌粒(phagemid)

2.1.2试验动物

2.1.3抗原及试剂

2.1.4主要仪器和设备

2.1.5缓冲液和试剂配置

2.1.6培养基

2.1.7 ELISA相关试剂的配制

2.1.8偶联相关试剂的配制

2.1.9 PCR引物

2.1.10 ScFv基因组装方法

2.2.试验方法

2.2.1人工抗原的合成和鉴定

2.2.2动物免疫程序和检测

2.2.3 RNA的提取以及纯度和浓度的检测

2.2.4 cDNA第一条链的合成

2.2.5抗体基因片段的制备

2.2.6噬菌粒载体pCANTAB-5E和ScFv基因的内切酶消化

2.2.7连接

2.2.8电转化

2.2.9转化子的鉴定

2.2.10辅助噬菌体M13K07的制备

2.2.11噬菌体抗体库的构建

2.2.12噬菌体抗体库容量的测定

实验研究:3.结果和分析

3.1抗体效价

3.2总RNA纯度

3.3 VH、VL、Linker基因扩增产物

3.4 ScFv基因组装

3.5 ScFv的两种基因连接方法比较

3.6转化子鉴定

3.7库容量

实验研究:4.讨论

4.1.人工抗原的合成

4.2关于小鼠免疫

4.3.关于ELISA方法建立

4.4.关于RNA提取与纯化

4.5关于cDNA合成

4.6.关于组装

4.7关于组装方法的比较

4.8.关于库容

参考文献

研究生期间发表的论文目录

致谢