水稻花药中Ca的定位与花粉细胞骨架荧光标记方法的探索

摘要

光敏雄性核不育水稻是培育杂交稻的重要种质资源，其雄性不育的细胞学机制与很多方面有关，包括绒毡层发育、ATP酶、ca2+浓度、细胞骨架和细胞程序性死亡等。Ca2+作为植物的第二信使广泛参与并调节着植物体内的生理生化反应，其在花药发育过程中对花粉形成和发育起重要作用；细胞骨架紊乱导致细胞死亡的现象比较普遍。因此，研究不育水稻花药发育过程中Ca2+分布以及细胞骨架的变化与花粉败育的关系，有助于揭示光敏核不育水稻雄性不育的机理。 本文采用焦锑酸钾沉淀法，观察了光敏核不育水稻(PGMR)农垦58S和正常可育品种农垦58N花药发育过程中药隔、药壁和花粉细胞中Ca2+的分布差异，分析不育花药中Ca2+分布与花粉败育的关系；以水稻为研究材料，采用几种不同的方法获得花粉细胞，分别进行微丝和微管的荧光标记和观察。 主要研究结果如下： 1.花药发育过程中Ca2+异常分布及其与雄性不育的关系 (1)可育花粉单核晚期细胞表面聚集丰富的Ca2+沉淀，花粉壁发育完全，细胞质中Ca2+颗粒很少；而不育花粉细胞表面Ca2+较少，花粉外壁发育异常，不形成花粉内壁，细胞质中积累丰富的Ca2+沉淀。 (2)可育花药绒毡层细胞在单核早期开始解体，单核晚期迅速解体；而不育花药在花粉母细胞时期启动解体，解体过程十分缓慢，一直持续至花粉败育。不育花药较可育花药提前形成乌氏体，但其表面无Ca2+沉淀分布，直到单核晚期才有明显分布，数量少于同期可育花药。除乌氏体以外，不育花药各壁层细胞中的Ca2+沉淀多于可育花药。 (3)花药发育过程中，不育花药和可育花药药隔组织中的Ca2+沉淀都呈逐渐增多的趋势，同期相比，不育花药多于可育花药。 结果表明，光敏核不育水稻绒毡层细胞提早解体及乌氏体功能异常，导致Ca2+向药室的运输发生障碍，致使花粉表面缺乏Ca2+而引起花粉外壁形成不正常；花粉发育后期细胞质内积累大量Ca2+是花粉败育的主要因素之一。 2.花粉细胞骨架荧光标记方法 (1)多聚赖氨酸粘片法：固定花药后压片，挤出花粉于涂有多聚赖氨酸的盖玻片上，对黏附在盖玻片上的花粉进行酶解和标记。结果表明，实验过程中花粉较易脱落，且一些组织碎片影响荧光观察，不易进行后期花粉标记，也不易进行微管荧光标记。 (2)研磨—离心法：固定小花后，研磨压出花粉，过滤，离心收集花粉，在离心管中对花粉进行酶解和标记。结果表明该法与粘片法相比，花粉细胞损失很少，制片上的花粉细胞分布均匀，无背景杂质影响荧光观察。只是此法不易获得早期花粉细胞。采用此法，分别设酶解时间梯度和标记液浓度梯度来摸索最佳标记条件，结果表明：标记微丝以酶解15～30min为宜，标记微管以酶解0.5～1h为宜；适当降低标记液浓度可使标记效果更好。 (3)冰冻切片法：固定小花后，进行冰冻包埋，冷冻后切片，真空粘片后脱包埋剂再进行标记。此技术克服了以上两种方法存在的问题，可以方便快捷地获得各时期的花药结构，DAPI染核效果很好，但是荧光标记效果不太理想，药壁组织细胞荧光信号很强，无法分辨花粉中微丝和微管的特异性荧光。 结果表明，粘片法和研磨一离心法虽各有优缺点，但可以用于微丝和微管的荧光标记，观察花粉发育中细胞骨架的动态变化，可以将两种方法结合起来使用，采用粘片法标记早期花粉细胞，采用研磨—离心法标记后期花粉细胞。

目录

文摘

英文文摘

声明

1文献综述

1.1课题的提出

1.2 Ca2+在植物细胞中的存在形式、分布及生理功能

1.3花药发育过程中Ca2+的分布及功能概述

1.4花药中Ca2+异常分布与花粉败育关系的研究概况

2材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

3结果与分析

3.1小孢子形成和花粉发育过程中Ca2+的分布

3.2花药发育过程中药壁组织中Ca2+的分布

3.3花药发育过程中药隔组织中Ca2+的分布

4 讨论

4.1可育花药发育过程中Ca2+的分布和运输

4.2不育花药中Ca2+的异常分布与花粉败育的关系

图版和图版说明

第二章水稻花粉发育过程中细胞骨架荧光标记体系的建立

1文献综述

1.1细胞骨架的结构与功能

1.2细胞骨架结构及功能的研究进展

1.3细胞骨架荧光标记体系概述

1.4激光扫描共聚焦显微镜在荧光观察中的应用

1.5课题的提出

2材料和方法

2.1几种试剂的配置

2.2采用不同方法获得花粉细胞

2.3荧光标记最佳条件摸索

2.4激光扫描共聚焦显微镜荧光观察

3结果与分析

3.1试剂的配制

3.2不同方法获得花粉细胞

3.3荧光标记的最佳条件

3.4采用激光扫描共聚焦显微镜观察荧光

4讨论

4.1有效获得花粉细胞的途径

4.2完善实验条件获得最佳标记效果

4.3激光扫描共聚焦显微镜在荧光观察中的应用

5总结和展望

图版和图版说明

参考文献

致 谢