猪抵抗素和内脏脂肪素基因的克隆、表达与猪抵抗素多克隆抗体制备研究

摘要

抵抗素(resistin)和内脏脂肪素(visfatin)是最新发现的两个脂肪细胞因子，二者与肥胖、脂肪组织的形成以及代谢综合症的产生密切相关。本课题以长白猪为研究对象，克隆并优化表达了猪抵抗素和内脏脂肪素基因，制备了猪抵抗素多克隆抗体，构建了猪内脏脂肪素真核表达载体。本课题为研究抵抗素和内脏脂肪素对脂肪代谢作用机制以及瘦肉型猪的选择育种提供了相关资料，也可为进一步研究抵抗素和内脏脂肪素在代谢综合症中的作用机制以及代谢综合症类疾病治疗药物的研制提供参考。主要研究结果如下： 1.序列克隆与分析：根据GenBank序列信息，应用RT-PCR，从长白猪肠系膜脂肪组织cDNA文库克隆出约360bp抵抗素编码区序列和约1.5kb内脏脂肪素编码区序列，并已提交美国国家生物信息中心(NCBI)GenBank数据库(EU1707339)。序列分析发现，长白猪与梅山猪抵抗素编码区序列完全一致，而内脏脂肪素CDS区第47位和第115位存在碱基差异(分别为A-G和T-C转换)。 2.猪抵抗素原核表达载体pGEX-KG-Rest构建与高效表达条件：根据已克隆的长白猪抵抗素序列，设计引物，PCR扩增成熟肽编码区、酶切、亚克隆至原核表达载体pGEX-KG，经宿主菌筛选后，进行培养基pH值以及诱导时间、IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷)诱导浓度、诱导温度等条件优化研究。pGEX-KG-Rest高效表达条件为：诱导最佳时间3h；IPTG最佳诱导浓度为0.3mmol/L；30℃优于37℃诱导；Rosetta表达菌优于BL21表达菌；培养基pH6.5和pH7.8时表达量较高。 3.兔抗猪抵抗素融合蛋白多克隆抗体制备：选取最佳表达菌株，制备猪抵抗素重组蛋白，包涵体提取和蛋白复性后，用弗氏佐剂混合免疫新西兰大耳兔，3次免疫后获得较高效价(1:16)兔抗猪抵抗素融合蛋白多克隆抗体。 4.猪内脏脂肪素原核表达载体pGEX-KG-Vis构建与高效表达条件：根据已克隆内脏脂肪素基因序列信息，设计扩增全长CDS区引物。PCR扩增、酶切、亚克隆至原核表达载体pGEX-KG，经表达宿主菌株筛选后，进行表达诱导时间、诱导剂IPTG诱导浓度梯度研究和SDS-PAGE检测鉴定。pGEX-KG-Vis高效表达条件为：诱导最佳时间2h，诱导最佳IPTG浓度0.1mmol/L，Rosetta表达菌优于表达菌BL21。 5.猪内脏脂肪素真核表达载体pcDNA3.1(+)-Vis构建：根据已克隆的内脏脂肪素基因序列和pcDNA3.1(+)载体信息，设计扩增全长CDS的引物，PCR扩增、酶切、亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)。重组载体经鉴定达到预期要求。

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论文说明：缩略词表

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第一章文献综述

1.抵抗素简介与研究进展

1.1抵抗素分子生物学特征

1.2抵抗素作用机制

1.3抵抗素信号转导通路

1.4抵抗素与相关疾病的研究进展

1.5猪抵抗素研究进展

2.内脏脂肪素简介与研究进展

2.1 Visfatin分子生物学特征

2.2 Visfatin调节表达与作用机制

2.3Visfatin信号转导通路

2.4 Visfatin与疾病相关研究进展

第二章猪visfatin基因的克隆与表达研究

1目的和意义

2材料和方法

2.1材料

2.2方法

3结果

3.1猪肠系膜脂肪总RaNA提取结果与分析

3.2猪visfatin编码区克隆结果与分析

3.3猪visfatin真核表达载体构建结果与分析

3.4猪visfatin原核表达载体构建结果与分析

3.5猪visfatin原核表达与表达菌株筛选结果

3.6猪visfatin原核表达条件优化结果与分析

4讨论

4.1关于猪visfatin基因的克隆

4.2关于猪visfatin真核表达载体构建与原核表达

第三章猪抵抗素基因克隆表达与多克隆抗体制备

1目的和意义

2材料和方法

2.1材料

2.2方法

3结果

3.1猪肠系膜脂肪总RNA提取结果与分析

3.2猪抵抗素编码区克隆结果与分析

3.3猪抵抗素原核表达载体构建结果与分析

3.4猪抵抗素原核表达与表达菌株筛选结果

3.5猪抵抗素原核表达条件优化结果与分析

3.6猪抵抗素原核表达蛋白包涵体提取结果

3.7兔抗猪抵抗素多克隆抗体制各结果

4讨论

4.1关于猪抵抗素基因克隆与表达条件

4.2关于兔抗猪抵抗素多克隆抗体制备

参考文献

致 谢