猪PNLIPRP2基因的克隆、原核表达、启动子调控及其与生产性状的关联分析

摘要

脂肪酶基因家族在脂类代谢和运输中起重要作用，和一些严重的疾病如肥胖，糖尿病和脂肪沉滞性动脉硬化症等相关联。胰脂肪酶相关蛋白2基因(pancreaticlipase-related protein2，PNLIPRP2)属于脂肪酶基因家族。在人上的研究表明，PNLIPRP2参与肠内的脂解作用。同时在鼠上也发现PNLIPRP2对乳鼠日粮中的脂肪消化起重要作用。当日粮脂肪含量达到4％时，TH鼠(一种研究Ⅱ型糖尿病的模型动物)选择性地下调PNLIPRP2的表达量，导致脂肪沉积，体内的血糖增高。本研究将其做为影响猪脂肪沉积的一个候选基因，对其进行了克隆、表达谱、原核表达、启动子调控、多态性检测及其与生产性状的关联分析等研究。本研究为进一步探讨该基因对影响猪脂肪沉积的作用打下了基础，并为其将来应用于分子标记辅助选择育种奠定了分子遗传基础。主要研究结果如下：
　　 1.以人PNLIPRP2基因cDNA为探针，在NCBI的EST数据库中比对得到猪EST序列并进行拼接。根据拼接序列设计引物克隆出猪PNLIPRP2基因cDNA编码区全长序列。通过外显子设计引物扩增出了猪1、3、4内含子序列，内含子剪接位点序列符合GT-AG法则，同时通过生物信息学及比较基因组学的策略鉴定了该基因的其它内含子序列。将该基因的cDNA序列和DNA全长提交到GenBank，获得基因收录号EU715062和EU715063。利用CLUSTALW、TMprep、Signal P3.0、ProtParam等软件对所编码蛋白质的结构、功能等特征进行了预测和分析，并构建了系统进化树。
　　 2.半定量组织表达谱的研究发现，PNLIPRP2在二月龄大白猪小肠中表达量较高，在脑、脂肪中表达量较低，在骨髓、胃中表达量更低，在其它组织中几乎不表达。PNLIPRP2在四月龄大白猪小肠中表达量也很高，卵巢中的表达量次之，在其它组织中的表达量很低。
　　 3.在第3内含子93bp处发现了大白T/梅山C的碱基突变，并建立了PCR-Eco130Ⅰ-RFLP的检测方法。分析了在不同猪群中这个突变位点的多态性，计算了这个位点的基因型和基因频率，并发现各基因型在不同品种中的分布存在一定差异。对“大白×梅山”资源家系F2代223头个体的基因型与胴体性状和肉质性状进行关联分析，显示该突变位点与6-7腰椎间背膘厚、失水率、系水力和背最长肌色值有显著的相关(P＜0.05)。
　　 4.构建了猪PNLIPRP2蛋白保守结构域的重组原核表达载体PGEX-KG-PLAT PL，利用SDS-PAGE检测出该重组原核表达载体成功表达出了猪PLAT PL蛋白。
　　 5.通过基因组PCR步移法从猪的基因组中扩增出了PNLIPRP2基因翻译起始位点上游3.7Kb的序列，并且运用NNPP、MethPrimer、TRANSFAC等生物信息学软件对猪PNLIRP2基因的核心启动子、转录起始位点、CpG岛的分布以及与启动子相结合的转录因子进行了预测和分析。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:资源家系测定性状的英文缩写

声明

第一章文献综述

1.前言

2.影响脂肪代谢的重要候选基因

3.拟分离基因的研究现状

3.1胰脂肪酶基因家族概述

3.2 PNLIPRP2基因的研究现状

3.3 PNLIPRP2基因与脂肪代谢

4.基于EST的新基因克隆策略

4.1 EST的概念及技术原理

4.2基因的电子克隆

5.单核苷酸多态概述

5.1 SNPs的概念

5.2猪分子育种中SNPs常用的检测方法

6启动子的研究方法

6.1启动子克隆方法

6.2本研究采用的启动子扩增方法

6.3启动子结构和功能的研究方法

第二章本研究的目的和意义

第三章材料与方法

1.试验材料

1.1试验样品和性状测定

1.2主要仪器和设备

1.3载体和菌株

1.4主要药品及试剂

1.5主要试剂的配制

2.试验方法

2.1猪基因组DNA的提取

2.2基因组DNA的浓度测定和质量检测

2.3猪PNLIPRP2基因cDNA序列的克隆、测序

2.4常用的分子生物学软件

2.5猪PNLIPRP2基因基因组序列的克隆测序

2.6猪PNLIPRP2基因组织表达谱研究

2.7猪PNLIPRP2蛋白保守结构域的原核表达

2.8猪PNLIPRP2基因启动子的研究

第四章结果与分析

1.猪PNLIPRP2基因cDNA序列的分离与克隆测序结果

1.1总RNA的提取与质量检测结果

1.2猪PNLIPRP2基因cDNA扩增结果

1.3猪PNLIPRP2基因cDNA序列的生物信息学分析

2.猪PNLIPRP2基因部分基因组序列的克隆

3.猪PNLIPRP2基因的SNPs研究

3.1猪PNLIPRP2基因的SNPs检测

3.2不同猪种中基因型频率的检测结果

3.3猪PNLIPRP2基因Eco130 I-RFLP基因型与性状的统计分析

4.猪PNLIPRP2基因的半定量组织表达谱分析

5.猪PNLIPRP2蛋白保守结构域的原核表达结果

5.1猪PNLIPRP2蛋白保守结构域PLAT_PL的扩增结果

5.2猪PNLIPRP2蛋白保守结构域原核表达载体的构建

5.3重组原核表达载体的鉴定

5.4 IPTG诱导重组原核表达载体表达PLAT_PL蛋白

6.猪PNLIPRP2基因启动子的克隆及生物信息学分析

6.1基因组步移库的构建

6.2猪PNLIPRP2基因启动子的获得

6.3生物信息学预测PNLIPRP2核心启动子区及转录因子结合位点

第五章讨论

1.关于候选基因的选择

2.关于猪PNLIPRP2基因结构的分析

3.关于基因的组织表达谱分析

4.关于基因的SNPs检测及性状的关联分析

4.1基因的SNPs检测

4.2性状关联分析

5.关于启动子序列的克隆及分析

5.1关于启动子序列的克隆

5.2关于启动子序列的生物信息学分析

第六章小结

1.本研究获得的结果及创新点

2.下一步工作

参考文献

致 谢