水稻T-DNA插入突变体库的创建及两个细胞壁合成相关基因的功能分析

摘要

在植物功能基因组研究中,突变体对基因功能的阐释具有重要作用。水稻是重要的粮食作物,而且是禾本科作物研究的模式植物。随着水稻基因组计划的完成,在全基因组水平上对整个水稻基因的功能进行阐释,成为当前水稻功能基因研究的重要目标。水稻突变体库的构建为水稻功能基因组研究提供了一个很好的工具与平台。
　　 本研究采用农杆菌介导的转基因方法,与本室其他成员共同完成了水稻T-DNA插入Enhancer trap突变体库转基因单株的创建,共得到转化单株129,000个,其中T-DNA插入阳性单株达到90％。本人对其中3006个家系进行了正常田间生长条件下的突变表型筛选,分秧田期与大田期对突变表型进行了观察。秧田期表型主要为黄化和白化,共得到121个白化突变体系,79个黄化突变体系,以及7个条纹叶。在大田生长期,共观察到了株高、叶色、叶片形态、抽穗期、穗形等突变表型的突变体系441个。对得到的所有的突变体家系进行了表型记录、照相以及初步的T-DNA插入共分离检测,检测结果提交到本室RMD突变体数据库(http://rmd.ncpgr.cn/),供全球共享。
　　 我们对03211FB78和03211GC09这两个细胞壁合成缺陷型的突变体进行了深入的研究。03211FB78是一个茎秆强度降低的突变体,我们把它命名fcl。fcl突变体在田间表现出了晚抽穗、半矮、易倒伏的表型。突变体茎秆强度比野生型植株降低50％以上,茎横切面的扫描电镜观察显示,突变体外围厚壁组织细胞细胞壁单薄,细胞壁增厚不明显,并且其外层维管组织细胞结构松散,表现出明显的细胞壁缺陷。对fcl突变体的细胞壁化学成分分析表明,突变体纤维素含量相对于野生型降低14％,木质素含量降低18％,含水量升高12％。使用DFRC的方法对突变体木质素单体成分进行测定的结果表明,H型、G型和S型木质素分别降低了36.84％、19.93％和16.69％。使用Wieaner染色和M(a)ule染色这两种组织化学染色方法对突变体茎秆第二节间的木质素变化部位进行了追踪,结果表明突变体的下表皮厚壁组织和维管组织木质素含量比野生型有明显的降低,并且突变体下表皮厚壁组织和维管组织细胞壁变薄。分子检测表明,fcl突变体是由一个肉桂醛脱氢酶基因(CAD)失活造成的,此基因参与了植物木质素的合成。RT-PCR的的结果显示,FC1基因在苗期的表达量相对于抽穗期要稍高,并且在根、茎、叶中的表达量差异不大。组织原位杂交表明FC1基因主要在维管束以及皮层厚壁组织细胞这样一些木质化程度比较高的细胞中表达。对突变体不同组织部位的总蛋白进行CAD酶和SAD酶活性测定发现,CAD酶活性在茎秆第一节间和穗这两个FC1基因表达量比较高的地方降低很多,SAD酶的活性在突变体与对照中都较低。综合以上这些结果显示了FC1基因在木质素的生物合成以及调控茎秆强度上有重要的作用。
　　 03Z11GC09突变体的田间表型为矮小、分蘖少、抽穗迟,并且在温室中其表型有所恢复。分子检测显示,T-DNA插入造成了一个水稻甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)基因的失活。在水稻中共有16个GPAT基因,根据基因家族的聚类分析,我们将此基因命名为OsGPAT11。OsGPAT11基因主要在苗期、茎以及花中表达,体外酶活测定显示其具有酰基转移酶的活性。对osgpat11突变体的叶片总甘油酯、表面蜡质的分析结果并没有发现与野生型有显著差异,但是其叶片角质单体比野生型显著降低。osgpat11突变体对非生物逆境的抗性显著降低,对旱胁迫和盐胁迫比野生型更加敏感,叶片失水速度比野生型显著提高。对突变体在胁迫过程中的ABA含量测定结果表明,osgpat11突变体中ABA的生物合成没有受到影响。综合这些结果显示OsGPAT11基因参与了植物叶片表皮角质的合成,其失活造成了osgpat11突变体表皮角质含量的减少以及抗逆性的显著降低。