水稻T-DNA插入突变体库的筛选及与水稻颖花颖壳发育相关基因的克隆与功能分析

摘要

T-DNA标签是一种高通量的分离和克隆植物功能基因的方法，目前在拟南芥等双子叶植物中已得到广泛应用，但在水稻等单子叶植物中尚处于探索阶段。本文通过对4416份T1代水稻T-DNA标签系的筛选，对T-DNA插入产生的突变类型、不同性状的突变频率、表型突变体的筛选程序、T-DNA侧翼序列的分离方法及整合特性等进行了研究和探讨；对获得的一个颖花颖壳缺失的突变体，进行了对应基因的克隆、功能验证、表达模式分析；对一个多重颖壳突变体开展了形态学观察和初步遗传分析。获得的主要研究结论有： 1、对以中花11(ZH11)、中花15(ZH15)为受体亲本构建的4416份T1代标签系进行了表型鉴定，发现存在拟纯合突变和系内分离突变两种类型；突变表型涉及株高、生育期、叶形、叶色、分蘖力、植株松紧度、穗颈节、穗形、颖花、粒形、类病变、雄性不育、生长极性等14类性状。其中，株高、生育期、叶色、雄性不育等性状有着相对较高的突变频率(＞1％)，株高和叶色的突变频率在品种及年度间表现稳定，而生育期、雄性不育波动较大，表明这类性状的表型易受环境影响。通过T1、T2连续世代的共分离分析，初步筛选出3个与穗部或颖花发育相关的T-DNA插入突变体，其频率约为1.37‰。为分离相关功能基因奠定基础。 随机选择42份有表型突变的标签系，通过质粒拯救和TAIL-PCR的方法，从39个标签系中分离获得40条T-DNA侧翼序列，其中26条为载体序列，14条与水稻基因组有很好的同源性，Blastn分析结果表明T-DNA有优先整合进植物功能基因内部的特性。 建立的质粒拯救和TAIL-PCR两种分离T-DNA侧翼序列的方法，相比较而言，前者对某个特定标签系，筛选含有T-DNA侧翼序列的阳性克隆获得率及测序效率较高，分离片段较长，但对DNA质量要求较高，操作过程繁琐，工作量较大；而后者对大规模分离侧翼序列、建立侧翼序列库而言扩增效率较高，且操作简单、方便、快捷，但就某个特定标签系特异PCR产物的获得率相对较低，且分离的序列片段一般长度较短。两种方法结合使用，对某个特定标签系其侧翼序列的分离就会有很大的几率。 2、对一个初步确认的颖花颖壳退化的T-DNA插入突变体(degeneratedhull1，dh1)，开展了基因克隆和功能分析研究。解剖镜观察结果表明dh1突变体表现为大部分颖花(≈70％)的内、外稃缺失，同时伴有雌雄蕊数目的异常，少量颖花(≈30％)的内、外稃表型正常，但雌雄蕊发育畸形。扫描电镜和石蜡切片的结果显示dh1突变体能进行正常的幼穗苞原基、一次枝梗和二次枝梗的分化和发育，进入颖花器官分化后，部分颖花虽然能分化出护颖，却在内、外稃的分化上表现为功能的缺失：部分颖花内、外稃发育提前终止或滞后于雌雄蕊的发育，部分颖花表现出不均衡分裂而产生数目异常的雄蕊，部分颖花雌蕊异常发育而呈现多柱头或2朵小花的雌雄蕊器官分化后融合在一起的异常现象。上述结果表明DH1基因对颖花内外稃的形态建成具有重要作用，同时与雌雄蕊的分化、发育也相关。 Southernblotting结果显示T-DNA在dh1突变体中仅有1个拷贝。通过TAIL-PCR的方法，获得了全长361bp的T-DNA侧翼序列，Blastn结果显示其对应于粳稻日本晴第2染色体的PAC克隆“P0474F11”的一段序列，基因预测结果显示T-DNA插入到了距一个预测功能基因的、转录起始点上游283bp的位点。通过T-DNA序列的特异引物与T-DNA插入位点两侧的基因组引物的不同配对进行PCR扩增，验证了侧翼序列与突变表型共分离。在幼穗分化期取样进行RT-PCR分析，结果显示dh1突变体目标候选基因(DH1)的转录水平较野生型明显降低。因而，初步确认T-DNA片段插入到目标基因DH1的启动子附近或重要调节序列之中，而产生了功能丧失突变。结构域分析结果显示，DH1编码的氨基酸序列含有保守的LOB(Lateralorganboundaries)结构域，同时能形成卷曲螺旋(Coiledcoil)二级结构，为典型的LBD(LOBdomaingenes)基因家族成员。 对DH1基因的RNAi可部分再现dh1突变体的表型，功能互补试验则表明野生型DH1基因能恢复dh1突变体的表型，从而对DH1基因的功能进行了可靠验证。DH1基因的原位过量表达，可导致产生植株矮小、穗轴和枝梗变短、叶片下垂等表型，与拟南芥中部分LBD基因过量表达的表型具有相似性。通过构建pDH1：：GFP的融合表达载体，研究目标基因的表达模式，结果发现DH1不仅具有仅在腋芽和幼穗中表达，而不在根、叶、节或节间等器官中表达的空间特性，同时还有在幼嫩器官中较强表达、而在发育成熟器官中减弱表达的时间特性。 dh1突变体在长光照条件下抽穗比在短光照条件下抽穗有更严重的颖花颖壳缺失。对DH1基因的启动子区域进行信号调控元件分析，发现该区域存在大量的光调控元件，从而暗示有两种可能：一是DH1基因在长光照条件下表达量相对较低，T-DNA插入进一步下调其表达，而产生较明显的突变表型；而在短光照条件下，DH1基因表达量相对较高，T-DNA插入尽管下调其表达，但仍有一定的绝对表达量，因而其对颖花颖壳及其内部器官的分化影响较小，突变表型相对较轻。二是DH1基因的表达受长光照条件的诱导，T-DNA插入下调其表达，产生颖花颖壳退化表型：同时，短光照条件可诱导与DH1功能冗余的相关基因的表达，能够部分补偿DH1丧失突变的功能，从而使dh1突变体在短光照条件下能够部分恢复正常表型。 大多数已克隆的控制颖花器官发育的基因均属于MADS-box基因家族。选择与水稻颖花器官发育相关的5个MADS-box基因进行RT-PCR分析，结果显示其在dh1突变体与野生型对照中的表达完全一致，初步揭示DH1基因可能涉及了非MADS-box基因的功能信号途径而参与对颖花构成器官的发育调控。 本研究克隆的DH1基因，是一个典型的LBD基因，这是在水稻上首次证明LBD基因参与水稻颖花的发育调控，该基因的克隆及功能验证对阐明和丰富水稻颖花发育的分子调控理论具有重要意义。同时，颖花的发育是水稻产量、品质形成的基础。了解DH1与其它控制颖花器官发育基因的相互作用，将为提高稻谷产量、改进稻米品质提供理论依据。此外，本研究通过T-DNA标签方法成功分离了DH1基因，为在水稻等单子叶植物的功能基因组分析中大规模应用该技术提供了试验论证。 3、从T-DNA插入突变体库中筛选获得一个多重颖壳突变体(multipleglumes，mg)。解剖镜下观察，发现其内外稃伸长，同时伴有类颖壳状结构而普遍呈现多重颖壳；14.27％的颖花没有雌、雄蕊，23.72％的颖花包含有额外小花，62.01％的颖花其雌、雄蕊数目异常，分别变化在1-3枚和1-9枚之间，部分颖花的花丝基部可看到泡状透明瘤状物；突变体浆片稃片化而使其颖花在自然条件下不能开放，完全雄性和雌性不育。扫描电镜和石蜡切片结果观察揭示其幼穗苞原基、一次枝梗和二次枝梗原基分化正常，但进入颖花分化后，其雌、雄蕊原基的分化较迟，会继续进行类似多重颖壳状器官的分化；同时，颖花原基进行不均衡分裂，产生数目不等的雌、雄蕊。遗传分析显示该突变是一个单基因控制的隐性性状，并与T-DNA插入表现共分离。推断其是E类基因引起的功能突变。在获得侧翼序列并验证其与突变表型共分离的基础上，将为克隆mg功能基因奠定基础。

目录

摘要

第一章文献综述

第二章水稻T-DNA插入突变体库的筛选及遗传分析

第三章一个与水稻颖花颖壳发育相关基因的克隆及功能分析

第四章一个水稻多重颖壳突变体的形态学观察及初步遗传分析

参考文献

致谢

攻读博士期间发表的学术论文