基于活菌内标的单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR方法的建立

摘要

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种重要的食源性致病菌，广泛的分布于自然界，人体感染后的死亡率高达20％-30％。在美国每年约有2500起由单核细胞增生李斯特菌引起的食品中毒事件，其中致使患者死亡的高达500人（美国CDC），导致的经济损失高达23亿美元。近年来随着我国即食食品消费量的日益增加，单核细胞增生李斯特菌也逐渐成为威胁我国人民身体健康的主要食源性致病菌之一。因此，针对食品生产和消费中存在的单核细胞增生李斯特菌，建立一套快速、准确的检测方法非常必要。
　　 为解决传统PCR检测方法存在的不足，增加检测的准确性、可靠性和实用性，本文以单核细胞增生李斯特菌为研究对象，建立了一种广泛适用于食源性致病微生物检测的添加活菌内标的荧光定量PCR检测体系，可用于DNA提取前野生菌的准确定量和全程指示假阴性。主要研究内容和结果如下：
　　 1、四种细菌检测方法的比较：以单核细胞增生李斯特菌 CMCC54002作为待测菌株，比较了PCR检测方法与目前具有代表性的BIOLOG、VITEK和CRYSTAL，3种微生物快速检测系统，并对本实验室保存的9株单核细胞增生李斯特菌做了血清学分型。结果表明：这3种微生物快速检测系统与PCR检测方法相比，其前处理过程时间长，需分离出纯的单菌落，并且都只能鉴定到李斯特菌属。PCR方法通过设计单核细胞增生李斯特菌种特异性引物，可快速的鉴定出单核细胞增生李斯特菌，并且无需纯化检测样品。通过对本实验室保存的9株单核细胞增生李斯特菌进行血清学分析，结果表明本实验室菌株涵盖了单核细胞增生李斯特菌主要的致病血清型（1/2a、4b、1/2c、3b）。
　　 2、扩增内标的设计：针对单核细胞增生李斯特菌主要毒力基因hly的保守序列，设计了一对特异性引物和相应的检测探针，并利用DNA序列随机改组软件，根据目标片断的序列特征，生成了1000组随机改组序列，然后通过荧光探针设计软件分析和BLAST-N比对筛选，找到了一条软件评分最高且与其它致病微生物基因组序列非同源的内标序列，该序列与目标片断具有相同长度（65 bp）和GC含量（55.4％），从而保证两者PCR扩增效率的一致性。
　　 3、活菌内标的构建：选用温敏型的穿梭质粒pKSV7来构建同源重组载体pKSV7-UIKD，该载体上连有上下游同源序列、扩增内标序列及卡那抗性基因，与质粒上自带的氯霉素抗性基因一起作为共同筛选标记，进行单核细胞增生李斯特菌双交换突变株的筛选，经过10轮培养和筛选，重组几率约为1.3％（4/300）。筛选出的双交换菌株用PCR、RT-PCR和测序分析进行了验证，结果表明成功获得了含扩增内标序列的hly基因缺失突变株LM-IAC，并作为活菌内标用于后续研究。
　　 4、准确测定野生菌DNA提取前菌体量的荧光定量PCR检测体系（LM-IACAQ-PCR assay）的建立：（1）评价了野生菌与活菌内标的DNA提取效率和PCR扩增效率，结果表明活菌内标与野生菌在109 cfu-105 cfu的范围内其DNA提取效率是相似的（约10％），同时两者具有相似的PCR扩增效率（野生菌1.05、活菌内标1.06）。（2）建立了根据活菌内标数量计算DNA提取前野生菌体量的线性回归方程y=-0.313x-0.0773，回归方程的相关系数R2=0.9997，结果表明，根据该线性回归方程计算所得的DNA提取前野生菌菌体量与实际菌体含量基本一致，而由传统标准曲线法计算得到的菌体量要比实际量少一个数量级。
　　 5、全程指示假阴性的荧光定量PCR检测体系（LM-IAC EO-PCR assay）的建立：（1）运用BIOLOG系统、VITEK系统比较了野生菌和活菌内标的生化特性，结果表明野生菌与活菌内标对检测板上的各项生化物质利用能力基本一致。（2）通过均匀设计试验评价了不同活菌内标加入量对野生菌在增菌培养中的影响，结果表明102 cfu-104 cfu的活菌内标接种量不影响野生菌的生长，其生长代时分别为49min（野生菌）和55 min（活菌内标）。（3）将103 cfu数量级的野生菌与活菌内标分别接入牛奶、鸡肉和腌肉样品，用UVM选择性增菌液培养，并以不添加食品样品的UVM纯培养为阳性对照，分别取增菌O h、3 h、6 h的样品进行荧光PCR检测，结果表明阳性对照和牛奶样品中的野生菌和活菌内标不经过增菌培养即可检出，鸡肉样品经增菌3 h后野生菌和活菌内标方可检出，而腌肉样品要经增菌6 h后才可检出野生菌和活菌内标。这说明本研究建立的检测体系能够指示鸡肉和腌肉样品检测中的假阴性现象，有助于提高检测的准确率，同时可有效减少增菌时间。
　　 6、可用于单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌和副溶血弧菌普通PCR检测的多重扩增内标（multiple internal amplification control，mIAC）检测体系的建立：针对单核细胞增生李斯特菌hlyA基因、沙门氏菌invA基因和副溶血弧菌toxR基因设计特异性检测引物，根据这3对引物序列运用重叠PCR技术人工合成了1条多重扩增内标，可分别用于单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌和副溶血弧菌的普通PCR检测。含多重扩增内标的PCR检测体系的DNA检测灵敏度分别为：单核细胞增生李斯特菌，73.0fg/μl；沙门氏菌，5.04fg/μl和副溶血弧菌，76.4fg/μl。通过对40份鸡肉、60份牛奶和60份虾样品分别进行单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌和副溶血弧菌的人工污染试验，结果显示鸡肉样品有2份出现假阴性、牛奶样品有2份出现假阴性、虾样品有3份出现假阴性，说明本研究建立的检测体系在进行大量样品检测时能够有效指示假阴性，有助于提高检测的准确率，并降低检测成本。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

1文献综述

1.1单核细胞增生李斯特菌生物学特性

1.1.1基本特征

1.1.2分布

1.1.3生活周期

1.1.4对理化因素的抵抗力

1.1.5血清学分型

1.1.6主要毒力因子

1.1.7李斯特菌病的临床特征

1.1.8李斯特菌病的暴发情况

1.2单核细胞增生李斯特菌检测技术

1.2.1生化鉴定技术

1.2.2免疫学检测技术

1.2.3核酸分子杂交检测技术

1.2.4 PCR检测技术

1.3荧光定量PCR的原理和分类

1.3.1原理

1.3.2分类

1.3.3存在的缺点

1.4扩增内标的研究概况

1.4.1导致假阴性出现的原因

1.4.2扩增内标在PCR检测中的应用

1.4.3扩增内标的制备方法

1.5研究目标

2单核细胞增生李斯特菌的鉴定与验证

2.1材料与方法

2.1.1菌株

2.1.2培养基

2.1.3主要试剂及配制

2.1.4主要仪器设备

2.1.5菌株的培养和革兰氏染色

2.1.6 Biolog细菌鉴定系统

2.1.7 VITEK-32全自动微生物鉴定/药物分析系统

2.1.8 BD BBLCrystal细菌鉴定系统

2.1.9基于PCR技术的细菌鉴定方法

2.1.10血清学鉴定

2.2结果与分析

2.2.1 Biolog鉴定结果

2.2.2 VITEK-32鉴定结果

2.2.3 BD BBLCrystall鉴定结果

2.2.4 PCR方法鉴定结果

2.2.5各种鉴定方法的比较

2.2.6血清学鉴定结果

2.3讨论

3单核细胞增生李斯特菌活菌内标序列的设计与合成

3.1材料与方法

3.1.1菌种和质粒

3.1.2培养基及试剂的配制

3.1.3仪器和设备

3.1.4hly基因的保守区段分析

3.1.5特异性检测引物与探针的设计

3.1.6扩增内标序列的设计

3.1.7扩增内标序列的合成

3.1.8扩增内标序列与载体连接

3.1.9感受态细胞的制备

3.1.10连接产物的转化

3.1.1l阳性转化子的筛选

3.1.12质粒的提取

3.1.13阳性克隆的测序鉴定

3.2结果与分析

3.2.1hly基因序列比对结果

3.2.2引物与探针的合成

3.2.3扩增内标序列的筛选结果

3.2.4扩增内标序列的PCR检测

3.2.5阳性克隆片段的序列测定

3.3讨论

4带有内标序列的单核细胞增生李斯特菌突变株的构建

4.1材料与方法

4.1.1菌株

4.1.2培养基

4.1.3质粒

4.1.4主要试剂及溶液的配制

4.1.5主要仪器设备

4.1.6 DNA模板的提取

4.1.7引物的设计与合成

4.1.8 PCR扩增

4.1.9 PCR产物及载体的酶切、回收与纯化

4.1.10 DNA片断的连接

4.1.11感受态细胞的制备

4.1.12连接产物的转化

4.1.13重组质粒的快速鉴定

4.1.14质粒的提取

4.1.15重组质粒的酶切鉴定

4.1.16同源重组质粒pKSV7-UIKD的构建

4.1.17单核细胞增生李斯特菌感受态细胞的制备

4.1.18电转单核细胞增生李斯特菌感受态细胞

4.1.19质粒的提取

4.1.20阳性转化子的菌落PCR及酶切鉴定

4.1.21同源交换突变株的筛选

4.1.22同源交换突变株的PCR鉴定

4.1.23同源交换突变株的RT-PCR鉴定

4.1.24突变株内标序列的测序分析

4.2结果与分析

4.2.1 hly基因上游和下游同源片段的PCR扩增

4.2.2中间质粒pSK-UIKD的构建

4.2.3同源重组质粒pKSV7-UIKD的构建

4.2.4质粒pKSV7-UIKD的酶切鉴定

4.2.5同源交换突变株的获得

4.2.6同源交换突变株的PCR验证结果

4.2.7同源交换突变株的RT-PCR验证结果

4.2.8突变株内标序列的测序分析结果

4.3讨论

4.3.1同源重组质粒pKSV7-UIKD的构建

4.3.2同源重组质粒pKSV7-UIKD的电转化

4.3.3同源交换突变株的筛选与鉴定

5添加活菌内标的荧光定量PCR检测方法的研究

5.1材料与方法

5.1.1菌株

5.1.2培养基

5.1.3主要试剂

5.1.4主要仪器设备

5.1.5菌种活化与培养

5.1.6基因组DNA提取

5.1.7含扩增内标荧光定量PCR检测方法的建立

5.1.8含扩增内标荧光定量PCR检测方法的评价

5.1.9活菌内标在准确定量中的运用(LM-IACAQ-PCR)

5.1.10活菌内标在全程监控假阴性中的运用(LM-IAC EQ-PCR)

5.2结果与分析

5.2.1荧光阈值的设定

5.2.2TaqMan探针浓度的选择

5.2.3活菌内标添加量的确定

5.2.4特异性评价

5.2.5灵敏度评价

5.2.6 DNA提取方法的选择

5.2.7野生菌和活菌内标PCR扩增效率的评价

5.2.8野生菌和活菌内标DNA提取效率的评价

5.2.9回归方程的建立

5.2.10 LM-IAC AQ-PCR定量方法的评价

5.2.11野生菌与活菌内标生化特性比较

5.2.12野生菌和活菌内标生长曲线的测定

5.2.13混合培养中活菌内标平板计数卡那霉素加入量的确定

5.2.14混合培养中活菌内标加入量对野生菌生长的影响

5.2.15 LM-IAC EQ-PCR全程监控假阴性的评价

5.3讨论

5.3.1活菌内标在单核细胞增生李斯特菌准确定量中的运用

5.3.2活菌内标在荧光定量PCR检测中全程监控假阴性的运用

6添加多重扩增内标的PCR检测方法的建立

6.1材料与方法

6.1.1供试菌株

6.1.2培养基及试剂的配制

6.1.3仪器和设备

6.1.4 DNA模板的提取和定量

6.1.5含多重扩增内标的PCR检测方法(mlAC PCR)的建立

6.1.6 PCR结果的电泳检测

6.1.7 mlAC PCR检测方法的评价

6.2结果与分析

6.2.1多重内标的PCR验证

6.2.2未添加多重扩增内标时的纯DNA检测灵敏度

6.2.3添加有多重扩增内标时的纯DNA检测灵敏度

6.2.4 mlAC PCR检测方法特异性评价

6.2.5人工污染样品的检测

6.3讨论

7结论及创新性

7.1结论

7.2特色和创新

参考文献

致谢

附录