口蹄疫病毒P1基因和乙型脑炎病毒E基因在转基因水稻中的表达及其免疫原性研究

摘要

口蹄疫病毒（FMDV）是严重危害猪、牛等经济动物的传染病，给畜牧业造成巨大的经济损失。预防和控制这种传染病的主要措施是对潜在易感宿主进行大范围全面地免疫接种。而目前用于预防口蹄疫的常规疫苗都存在潜在的散毒危险，因此研制新型疫苗迫在眉睫。
　　 乙型脑炎是一种由同本乙型脑炎病毒（JEV）侵犯中枢神经系统引起的潜在致命性传染病。此病可通过蚊子传染给人类，而猪是公认的主要扩增宿主和传染源。目前广泛使用的无论是人乙型脑炎鼠脑纯化灭活疫苗，还是猪乙型脑炎灭活疫苗或减毒活疫苗因为其生产费用昂贵、缺少长期免疫力，潜在的散度风险以及可能引起的过敏反应等，而限制了这些疫苗被广泛应用。
　　 植物可饲疫苗与传统疫苗相比具有无动物病原体污染、生产廉价、储存和运输热稳定等优势，近年成为研究的热点。水稻作为一种生物反应器，被广泛地用于表达人和动物病原体的抗原基因。在水稻中表达FMDV或JEV的免疫原蛋白来生产新型疫苗不失为一种经济实用的策略。针对以上两种病毒，本研究通过农杆菌侵染法获得了转口蹄疫O/ES/2001株P1基因和乙型脑炎SA14-14-2株E基因的转基因水稻，并在小鼠模型上对植物来源的P1蛋白和E蛋白的生物学特性和免疫原性经行了研究。具体研究内容包括：
　　 1．P1基因和E基因在水稻中的表达分析
　　 将本实验室保存的口蹄疫O/ES/2001株P1基因和乙型脑炎SA14-14-2株E基因首先分别克隆到真核表达载体pRTL2中，再将构建成的含有双CaMV35S启动子和NOS终止子的表达盒克隆到载体pCAMBIA1301中，分别命名为pCAMRT-P1和pCAMRT-E。用农杆菌法分别转化水稻品种同本晴（Nipponbare），经Southern blot，Northern blot和Western blot方法检测，P1基因和E基因均在在水稻中成功表达。经ELISA方法检测，P1蛋白表达量达到0.6至1.3μ g/mg植物总可溶性蛋白，E蛋白表达量达到1.1至1.9μ g/mg植物总可溶性蛋白。
　　 2．水稻来源的P1蛋白免疫原性研究
　　 将新鲜转基因水稻叶片进行研磨，取研磨液与不完全弗氏佐剂混合腹腔注射免疫小鼠。首免后第56天，植物来源P1蛋白诱导小鼠体内产生了高水平的口蹄疫病毒特异性血清IgG抗体；中和抗体水平达到1：20.27，与大肠杆菌来源的P1蛋白诱导的中和抗体相当（1：22.4）。用106TCID50口蹄疫病毒0/ES/2001株进行攻毒试验，攻毒48小时后检测小鼠血液中病毒清除情况显示，100％的小鼠血液没有引起细胞病变。
　　 用水稻研磨液口服免疫的小鼠36天后，解剖小鼠并收集近胃部小肠，清洗后进行体外培养3天。口服免疫的小鼠体内也产生了口蹄疫病毒特异性血清IgG抗体，并且水稻来源的P1蛋白诱导的抗体水平显著高于大肠杆菌来源的P1蛋白诱导的。小肠洗液和体外培养液中检测到粘膜IgA抗体，证明植物来源的P1蛋白经口服诱导了粘膜免疫。用106TCID50口蹄疫病毒0/ES/2001株进行攻毒试验，攻毒48小时后检测小鼠血液中病毒清除情况显示，只有20％-40％的小鼠血液没有引起细胞病变。
　　 3．水稻来源的E蛋白免疫原性研究
　　 保护动物不受JEV的感染主要依靠体内抗体水平，尤其是中和抗体水平。用2中的方法免疫小鼠，动物实验表明，植物来源E蛋白诱导小鼠体内产生了高水平的乙型脑炎病毒特异性血清IgG抗体；中和抗体水平达到1：19.2，显著高于用大肠杆菌表达的E蛋白诱导的抗体水平（1：11.2）。
　　 口服免疫30天后，小鼠体内也产生了乙型脑炎病毒特异性血清IgG抗体；小肠洗液和体外培养液中检测到粘膜IgA抗体，且抗体水平显著高于口服大肠杆菌来源的E蛋白的小鼠，证明植物来源的E蛋白经口服诱导了粘膜免疫。
　　 以上结果明水稻作为一种生物反应器可以成功表达口蹄疫病毒P1蛋白和乙型脑炎病毒E蛋白，为进一步研究针对这两种病毒的可饲疫苗奠定了基础。下一步研究工作可以从以下两个方面进行：用分子生物学的方法提高外源蛋白在水稻中的表达量，比如使用种子特异性表达的启动子；从佐剂的使用方面提高水稻来源蛋白的口服免疫效果，比如使用CT或LT为口服佐剂。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图表目录、缩略语表

声明

1前言

1.1转基因植物可饲疫苗的研究进展及其应用前景

1.1.1转基因植物可饲疫苗的诞生与发展

1.1.2转基因植物可饲疫苗的作用机理

1.1.3植物可饲疫苗的表达系统

1.1.4抗原在植物中的稳定性

1.1.5转基因植物可饲疫苗的优点

1.1.6植物疫苗研究存在的问题

1.2口蹄疫病毒研究进展

1.2.1口蹄疫的危害

1.2.2口蹄疫病毒

1.2.3口蹄疫病毒感染特性

1.2.4 FMDV转基因植物疫苗国外研究现状

1.3乙型脑炎研究进展

1.3.1乙型脑炎及其危害

1.3.2乙型脑炎感染特性

1.3.3乙型脑炎疫苗研究现状

2研究目的和意义

3材料与方法

3.1实验材料

3.1.1毒株、细胞、菌种与水稻品种

3.1.2载体与质粒

3.1.3工具酶及主要试剂

3.1.4培养基与抗生素及其配制

3.1.5缓冲液

3.1.6其它溶液

3.1.7实验动物

3.2试验方法

3.2.1限制性内切酶酶切反应

3.2.2线性质粒DNA末端去磷酸化

3.2.3 PCR产物或酶切产物回收与纯化

3.2.4外源DNA片段与质粒载体的连接反应

3.2.5大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)

3.2.6连接产物的转化

3.2.7质粒的制备与鉴定

3.2.8农杆菌介导的水稻遗传转化

3.2.9植物总DNA的提取和Southern blot印迹分析

3.2.10植物总RNA的提取和Northern blot印记分析

3.2.11植物总可溶蛋白的提取

3.2.12目的蛋白的原核诱导表达

3.2.13包涵体提取、纯化与复性

3.2.14 ELISA检测

3.2.15 Western blot检测

3.2.16目的蛋白在植物总蛋白中含量的测定

3.2.17半数细胞培养物感染量(TCID50)的测定

3.2.18微量中和试验(固定病毒-稀释血清法)

3.2.19动物实验

3.2.20小鼠小肠体外培养

3.2.21 FMDV强毒攻击试验

3.2.22统计学方法

4结果与分析

4.1口蹄疫病毒P1基因在水稻中的表达和免疫原性的研究

4.1.1 FMDV P1基因水稻表达载体pRTCAM-P1的构建

4.1.2转基因水稻中P1基因的Southern blot分析

4.1.3转基因水稻中P1基因的Northern blot分析

4.1.4转基因水稻中P1基因的Western blot分析

4.1.5转基因水稻中P1基因的表达量分析

4.1.6转基因水稻遗传稳定性研究

4.1.7腹腔注射实验组小鼠的免疫水平检测

4.1.8口服实验组小鼠的免疫水平检测

4.1.9攻毒后实验小鼠血清中FMDV清除情况

4.2乙型脑炎病毒E基因在水稻中的表达和免疫原性的研究

4.2.1 JEVE基因水稻表达载体pRTCAM-E的构建

4.2.2转基因水稻中E基因的Southern blot分析

4.2.3转基因水稻中E基因的Northern blot分析

4.2.4转基因水稻中E基因的Western blot分析

4.2.5转基因水稻中E基因的表达量分析

4.2.6转基因水稻遗传稳定性研究

4.2.7腹腔注射实验组小鼠的免疫水平检测

4.2.8口服实验组小鼠的免疫水平检测

5讨论

5.1外源蛋白在水稻中表达量分析

5.2转基因水稻表达的P1蛋白免疫原性研究结果分析

5.3转基因水稻表达的E蛋白免疫原性研究结果分析

5.4关于改进转基因植物可饲疫苗的设想

6结论

参考文献

附录

在读期间发表论文

致 谢