猪链球菌2型在猪脑内及热和氧应激条件下表达上调基因的筛选与功能研究

摘要

猪链球菌2型(Streptococcus suis serotyp2,SS2)是一种重要的人畜共患病原菌,可引起人的中毒性休克综合症和死亡,引起猪的脑膜炎、心内膜炎、败血症、关节炎、浆膜炎和肺炎,是猪的一种重要细菌性传染病,给养猪业造成重大的经济损失。荚膜多糖(CPS)、溶菌酶释放蛋白(MRP)、细胞外蛋白因子(EF)、溶血素和黏附素等是SS2的重要的毒力因子,但这些毒力因子并不能完全解释SS2的致病机理。广义的毒力因子应该包括那些与体内外环境应答有关的所有因子。所谓的环境应答即病原菌在感染过程中受到温度、渗透压、氧、pH及营养物质利用率等条件影响时所产生的变化。这些感染相关因子的鉴定与表达调控的研究,不仅有利于病原菌致病机理的解析,而且对疫苗、药物和诊断技术的设计与研制具有重要的指导意义。本研究运用转录序列选择性捕获(selective capture oftranscribed sequences,SCOTS)技术鉴定出SS2在高温、厌氧和感染猪脑组织中上调表达的基因,并对其中几种SS2细胞壁蛋白的免疫原性进行了研究,现将主要研究结果报告如下:
　　 1.猪链球菌2型在感染猪脑组织中上调表达基因的鉴定以1.5×105 CFUSS2 SC-19株鼻内接种5头健康仔猪,72h后采集感染猪的脑组织,提取总RNA,同时提取体外培养的SS2的总RNA,运用SCOTS技术进行六轮筛选,获得SS2在感染猪脑组织中的上调表达的基因71个。DNA序列分析结果表明,这些包括如下6类:与新陈代谢有关的有30个基因；与细胞壁有关的有12个基因；与复制有关的有9个基因；与蛋白有关的有3个基因；与转录有关的有9个基因；另外有8个功能尚不清楚。
　　 2.热应激和厌氧对猪链球菌2型的基因表达调控热应激与厌氧是两种很重要的环境信号,对病原菌的基因表达发挥重要的调控作用。本实验中,以常规体外培养条件为对照,用SCOTS技术筛选出SS2在高温条件下上调表达的基因33个、在厌氧条件下上调表达的基因21个,为SS2在应激条件下的基因表达调控的深入研究奠定了基础。
　　 3.体内诱导的猪链球菌2型胞壁蛋白的免疫原性研究从感染猪脑组织中筛选出的71个上调表达的基因中筛选出4个编码细胞壁相关蛋白的基因,进行了克隆表达和蛋白质纯化。将纯化的重组蛋白与氢氧化铝佐剂混合后免疫小鼠2次后,分别用2×LD50和5×LD50的SS2强毒株攻击。试验结果表明,4种重组蛋白均能诱导小鼠产生高滴度的抗体；在使用2×LD50的攻毒剂量时,4种重组蛋白免疫的小鼠都可以保护,但在使用5×LD50的攻毒剂量时,只有Hp0254和Hp1311N具有较好的保护力,可作为候选疫苗抗原。

目录

文摘

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国家高技术研究发展计划资助

缩略语表(Abbreviation)

第一章 文献综述

1.1 猪链球菌2型与细菌性脑炎

1.1.1 细菌性脑炎

1.1.2 猪链球菌2型

1.2 细菌的厌氧应激调控

1.3 细菌的热应激调控

1.4 病原菌体内诱导基因

1.4.1 体内诱导基因的意义

1.4.2 内诱导基因的筛选方法

第二章 猪链球菌2型在高温、厌氧和感染猪脑组织表达上调基因的鉴定

2.1 研究目的及意义

2.2 材料和方法

2.2.1 主要药品及试剂

2.2.2 培养基与抗生素及其配制

2.2.3 主要缓冲液

2.2.4 菌株、质粒及培养条件

2.2.5 实验动物与动物感染

2.2.6 本研究所用引物

2.2.7 质粒的小量制备

2.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.9 猪2型链球菌基因组DNA的制备

2.2.10 rRNA基因的克隆

2.2.11 猪2型链球菌RNA的提取及RT-PCR

2.2.12 SCOTS

2.2.13 Southern Dot Blot

2.2.14 基因测序与功能注释

2.3 结果与分析

2.3.1 猪链球菌2型16S rRNA与23S rRNA基因的克隆与序列分析

2.3.2 猪链球菌2型在高温、厌氧表达上调基因的鉴定

2.3.3 猪链球菌2型在感染脑组织表达上调基因的鉴定

2.4 讨论

第三章 猪2型链球菌候选保护性抗原的研究

3.1 研究目的及意义

3.2 材料与方法

3.2.1 主要试剂

3.2.2 主要缓冲液

3.2.3 菌株与培养条件

3.2.4 本实验所用引物

3.2.5 实验动物

3.2.6 pET-28a表达载体

3.2.7 猪2型链球菌基因组DNA的制备

3.2.8 疫苗候选蛋白的克隆表达及纯化

3.2.9 小鼠感染试验

3.2.10 小鼠免疫

3.2.11 小鼠免疫效力试验

3.2.12 小鼠抗体水平评价

3.3 结果与分析

3.3.1 免疫原性蛋白的重组表达纯化

3.3.2 小鼠感染试验

3.3.3 小鼠抗体水平评价

3.3.4 蛋白对小鼠免疫效力试验

3.4 讨论与结论

小结与展望

参考文献

致谢