魔芋软腐病菌致病性测定及遗传多样性分析

摘要

本研究从湖北魔芋主要产区采集魔芋软腐病害标本，对从中分离得到的59个魔芋软腐菌株进行致病性测定和生理生化特性比较，在此基础上，采用相关分子生物学方法从分子水平上对菌株进行鉴定，并对魔芋软腐菌群体遗传多样性进行了分析。取得的主要结果如下：
　　 1．魔芋软腐菌致病力分化：对分离保存的59个魔芋软腐菌保存菌株，经活化培养后，制备成浓度约为108cfu/mL的菌悬液，并将健康魔芋球茎切成直径1.5cm的打孔器切成圆球块，并将球块置于灭菌培养皿，每皿3个，每个处理设三个重复。用移液枪吸取100ul菌悬液分别进行人工穿刺接种，并用无菌水为对照，置于28℃保湿培养，接种5天后观察并记录魔芋球块腐烂情况。结果表明，供试的59个菌株致病力存在明显分化，根据其接种后腐烂程度，分为强、较强、中、弱四种类型，其中致病力强的有11株，约占18.6％；致病力较强的有14株，约占23.7％；致病力中等的有11株，约占18.6％；致病力弱的有24株，约占39.1％。进一步分析不同地理来源菌株致病力比较显示，不同地区魔芋软腐病菌株的致病力存在明显差异，同一地区菌株间致病力也不尽相同，由此说明引起湖北省魔芋软腐病的病原菌致病力的存在明显的分化现象且这种分化与地理位置没有直接的相关性。
　　 2．魔芋软腐菌相关生理生化特性的研究：对59个菌株进行革兰氏染色反应及氢氧化钾溶解试验，结果显示供试菌株均为革兰氏阴性菌。进一步对菌株进行耐盐性试验、葡萄糖氧化发酵试验、丙二酸钠的利用、柠檬酸盐的利用、H2S试验、吲哚试验、明胶液化试验、淀粉水解试验、过氧化氢酶测定，37℃生长试验、酪素水解和酪氨酸水解等相关生理生化鉴别试验，结果表明，供试菌株对应的生理生化反应结果各不相同。参考《伯杰细菌鉴定手册》第八版的主要生理生化鉴别性状，可将供试的59个菌株划分为两个不同的亚种，其中胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种Erwinia carotovora subsp．carotovora（Ecc）有52株，占总数的88.1％；菊欧文氏亚种Erwinia chrysantherni（Ech）有7株，占总数的11.9％。这一结果与已报道的魔芋软腐病的病原菌一致。研究说明，引起湖北省魔芋软腐病的病原菌主要是胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种；但也存在一定比例的菊欧文氏亚种，对此应根据软腐病菌种群变化控制病害的发展。
　　 3．魔芋软腐菌的ITS分子鉴定：本研究利用ITS-PCR扩增对供试的59株软腐菌株进行分子水平鉴定，同时根据其扩增的带型将其分为2个组群，即：胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种Erwinia carotovora subsp．carotovora（Ecc）组群和胡萝卜软腐欧文氏菌菊欧文氏亚种Erwinia chrysanthemi（Ech）组群。这样不仅从分子水平上对分离纯化的软腐菌株进行进一步的确定，还能与生理生化鉴定结果相互印证；
　　 4．魔芋软腐菌遗传多样性分析：以细菌通用引物BOX和J3为通用引物进行Rep-PCR扩增，对59个菌株进行DNA指纹图谱分析，研究发现经ITS-PCR鉴定的2个组群之间在遗传上有明显差异。虽同属于Ecc或Ech种群，但不同菌株带型上却表现出明显的多态性，说明各菌株在遗传水平上有明显的差异，也进一步表明湖北省引起魔芋软腐病的种群存在丰富的遗传多样性。
　　 从Rep-PCR指纹聚类图中可以看出，在连锁距离为0.5时，可以将供试的59个魔芋软腐菌株分为2个大的类群。从聚类图可以看出，每个类群都含有致病力不同的菌株。类群Ⅰ中的包含两个菌株，但二者的致病力却不同，SS4菌株属于致病力强的菌株，而WH2则属于致病力弱的菌株。类群Ⅱ中也表现出同样的情况，包含致病力强的菌株EBN3、EXH2、EJG1，也有致病力中等的EJJ1、EJH3、EXS2菌株，同时还有致病力弱的EBN1、EBN2、EBN4、EXH1、EXY1菌株；在连锁距离为0.48的时候，可以将供试的菌株分为4个组群，各组群菌株的致病力也存在很明显的分化。但在大的聚类组中，通常致病力相近的菌株聚在同一个小组中。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1魔芋概述

2魔芋用途

2.1药用价值

2.2实用价值

2.3农业上的应用

2.4化工工业中的应用

3魔芋软腐病

3.1魔芋软腐病发生危害情况

3.2魔芋软腐病的研究进展

3.3魔芋软腐病的综合防治

4植物病原细菌的鉴定

4.1植物病原细菌传统的鉴定方法

4.2植物病原细菌分子鉴定方法研究进展

5遗传多样性的研究现状及方法

5.1遗传多样性

5.2 rep-PCR

5.3 BOX-PCR技术在微生物多样性研究中的应用

6本研究的目的和意义

第二章魔芋软腐病病原菌的分离与致病性测定

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1菌株的分离纯化

2.2致病性测定

3讨论

第三章魔芋软腐菌菌株的生理生化鉴定

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1革兰氏染色

2.2 KOH溶解试验

2.2 37℃生长试验

2.4柠檬酸的利用

2.5吲哚的产生

2.6 5％NaCl生长

2.7过氧化氢酶的测定

2.8明胶液化试验

2.9丙二酸钠的利用结果

2.10葡萄糖的氧化发酵

2.11蔗糖的发酵试验

2.12乳糖的发酵试验

2.13酪素水解

2.14酪氨酸水解

2.15生理生化测定结果

3讨论

第四章魔芋软腐菌的ITS分子鉴定

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

3讨论

第五章魔芋软腐菌遗传多样性分析

1材料与方法

1.1材料

1.2.方法

2结果与分析

2.1 rep-PCR扩增结果

2.2 DNA指纹聚类结果分析

3讨论

参考文献

致谢