猪乙型脑炎病毒ELISA抗体检测方法的建立与应用

摘要

日本乙型脑炎（Japanese encephalitis，JE）简称乙脑，是由黄病毒科的乙型脑炎病毒（JE virus，JEV）引起的人畜共患性传染病。猪是本病的扩散宿主，主要引起猪的繁殖障碍性疾病。猪群中高水平的抗体有助于抵抗病毒传播，这在规模化养猪场有重要意义，也有重要的公共卫生学意义。因此，建立和完善乙型脑炎抗体水平的评价方法至关重要。
　　 本课题通过对比不同的ELISA方法，选择建立基于地鼠原代肾细胞病毒抗原的ELISA方法，主要包括以下三方面研究：
　　 1．病毒抗原的制备以及原核表达产物抗原的制备
　　 首先，将金黄地鼠原代肾细胞以及BHK-21细胞用于乙脑病毒（SA14-14-2株）的增殖，经硫酸铵沉淀法纯化病毒，作为抗原。同时，将病毒在7日龄鸡胚中增殖，收取病毒尿囊液并使用丙酮沉淀法制备病毒抗原。另外，采用原核系统表达乙脑病毒囊膜糖蛋白基因（E基因），提纯表达的E蛋白包涵体作为蛋白抗原。
　　 2．三种不同抗原包被的ELISA方法与康柏德ELISA试剂盒的比较
　　 以康柏德猪乙脑ELISA抗体检测试剂盒为标准，同时用以上三种抗原建立的ELISA方法检测72份猪血清。原代细胞源病毒抗原包被间接ELISA方法、鸡胚源病毒抗原包被的间接ELISA方法、E蛋白抗原包被的间接ELISA方法与标准试剂盒的符合率分别为82％、66.6％、58.3％。确定用原代肾细胞源病毒抗原用作包被抗原，用于猪乙脑ELISA抗体试剂盒的开发。
　　 3．地鼠原代肾细胞源病毒抗原作为包被抗原的ELISA方法研究
　　 方阵滴定确定该ELISA方法抗原的最佳包被浓度为1：3200，即4.5ug/mL，血清稀释液（正常BHK-21细胞悬液作为血清稀释液母液）最佳使用浓度为1：320，血清稀释度固定为1：100。检测115份乙脑抗体阴性血清，计算得该1份阴性血清平均值（X）为0.155，标准差（SD）为0.045，确定阴阳性临界点（X+3SD）为0.29。以该方法检测猪伪狂犬病、猪瘟、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征、弓形体、副猪嗜血杆菌、猪链球菌、猪支气管败血波氏杆菌的标准阳性血清，进行特异性试验，结果均为阴性。14份猪血清的重复试验，批内重复变异系数在0.16％～8.53％之间，变异系数（CV）<5％；批间重复变异系数在0.63％～17.2％之间，变异系数（CV）<5％。保存期试验表明，建立的试剂盒在37℃该方法可保存3天，在4℃可以保存4个月左右。该方法与康柏德猪乙脑ELISA抗体检测试剂盒的阳性符合率为84.6％，阴性符合率为77％，总符合率为82％。利用所建立ELISA方法检测湖北三个规模化猪场临床送检血清673份，共检出阳性血清108份，阳性率为16％。

目录

文摘

英文文摘

声明

1文献综述

1.1乙脑危害及流行特征

1.2乙脑的病原学特性

1.2.1分类及生物学特性

1.2.2增殖特性

1.3乙脑病毒的分子生物学特性

1.3.1基因组结构

1.3.2病毒表面囊膜糖蛋白

1.4乙脑的血清学诊断

1.5乙脑的预防

2研究目的与意义

3材料和方法

3.1材料

3.2方法

3.2.1猪乙型脑炎病毒阴阳性血清的制备

3.2.2乙脑基因原核产物的表达

3.2.3 SDS-PAGE蛋白凝胶电泳

3.2.4 Western blot

3.2.5基于乙脑基因原核产物间接ELISA方法的初步建立

3.2.6 RT-PCR方法

3.2.7空斑形成实验

3.2.8鸡胚尿囊液获得乙脑病毒抗原

3.2.9细胞获得乙脑病毒抗原

3.2.10乙脑病毒抗原浓度的确定以及ELISA方法的初步建立

3.2.11三种ELISA方法与康柏德猪乙脑ELISA抗体检测试剂盒间的比较

3.2.12病毒抗原ELISA方法的优化、试剂盒的研制与应用研究

4结果与分析

4.1 pGEX-E的表达及检测

4.2 JEV-E-ELISA的初步建立

4.2.1最佳包被条件的确定

4.2.2 ELISA阴阳性界限值的确定

4.3病毒毒种毒价的确定

4.3.1病毒毒种RT-PCR的鉴定

4.3.2毒种毒价的确定

4.4鸡胚中增殖乙脑病毒的研究

4.5乙脑病毒抗原的鉴定

4.6比较不同间接ELISA方法之间的符合率

4.6.1 E蛋白ELISA与康柏德猪乙脑ELISA抗体检测试剂盒的比较

4.6.2鸡胚源病毒ELISA与康柏德猪乙脑ELISA抗体检测试剂盒的比较

4.6.3细胞源病毒ELISA与康柏德猪乙脑ELISA抗体检测试剂盒的比较

4.7病毒抗原包被间接ELISA方法的研究

4.7.1病毒ELISA方法最佳致敏条件的选择(方阵滴定)结果

4.7.2 ELISA结果判定标准的确定

4.7.3重复性试验

4.7.4特异性试验

4.7.5稳定性试验

4.7.6病毒包被抗原间接ELISA与康柏德ELISA试剂盒符合率比较

4.7.7病毒抗原ELISA方法的临床检测结果

5讨论

6结论

参考文献

致谢

附录