PEG介导的玉米丝轴黑粉菌原生质体转化与ras、gpd启动子的克隆

摘要

玉米丝黑穗病是由玉米丝轴黑粉菌(Sporisorium reilianum f.sp.Zeae)引起的严重威胁玉米产量的系统性病害,一般在苗期侵染,穗期表现典型症状,主要危害果穗和雄穗,一旦发病,往往全株没有收成。本研究旨在构建PEG介导的玉米丝轴黑粉菌原生质体转化体系,并尝试克隆该菌基因组中ras、gpd基因的启动子,为发展出高效的玉米丝轴黑粉菌遗传转化体系和阐明其致病机制等方面奠定基础。主要结果如下:
　　 1、对玉米丝轴黑粉菌原生质体形成和再生条件进行探究,供试菌株为本实验室分离的丝轴黑粉菌菌株SR1,研究了不同菌龄、不同单酶以及不同浓度的单酶组合成混合酶液后的酶解效率,探讨了渗透压稳定剂、酶解温度、酶解时间等影响原生质体形成和再生的条件,得到了制备玉米丝轴黑粉菌原生质体的最优条件:SR1活化3d后以1/20的接种量继续培养约24h,离心收集担孢子用无菌水洗涤一次,加入含0.5％裂解酶、5％崩溃酶和5％蜗牛酶三种酶混合液(酶液以1.0M/L山梨醇配制)酶解,置于28℃、转速为100r/m的摇床上温育10min,原生质体产量可达1.35×108个/mL,得率可达到99.4％,再生率达35.6％。
　　 2、质粒DNA经PEG介导转化玉米丝轴黑粉菌原生质体,转化效率约10个转化子/μgDNA。筛选出稳定表达潮霉素B抗性的转化菌株,继代培养9代后仍有潮霉素抗性。PCR验证表明,外源DNA已经插入到丝轴黑粉菌基因组上,随丝轴黑粉菌转代而稳定遗传。
　　 3、克隆玉米丝轴黑粉菌ras与gpd启动子,以玉米丝轴黑粉菌基因组DNA为模板,根据以往报道的ras与gpd启动子相关序列设计引物,利用PCR方法克隆了ras、gpd1和gpd2三个启动子片段。DNA测序后经Blastn分析表明,ras序列与网上公布的香菇ras启动子序列有98％的同源性,gpd与草菇gpd基因启动子序列的同源性达99％。采用Promoter2.0 Prediction软件分析发现ras、gpd2为启动子的可能性很大,分值达0.652、0.565。这些片段都含有多个启动子核心序列和TATA-box,CAAT-box等顺式作用元件。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表

第一章 文献综述

1 玉米丝黑穗病的研究进展

1.1 玉米丝黑穗病的分布与危害

1.2 玉米丝黑穗病的症状

1.3 玉米丝黑穗病病原茵及其生理小种分化

1.4 玉米丝黑穗病菌的侵染机制研究

1.5 玉米丝黑穗病早期鉴定方法

2 真菌遗传转化研究进展

2.1 PEG介导的原生质体转化

2.2 根癌农杆菌介导的遗传转化

3 启动子克隆研究进展

3.1 启动子克隆的方法

3.2 外源基因表达及同源启动子克隆研究

3.3 ras与gpd启动子

4 本研究的目的和意义

第二章 丝黑穗病菌原生质体制备与转化

1 材料

1.1 菌种和载体

1.2 培养基

1.3 试剂

1.4 酶制剂

2 试验方法

2.1 生长曲线的测定

2.2 菌龄对原生质体的影响

2.3 原生质体的制备

2.4 原生质体的再生

2.5 原生质体得率和再生率的计算

2.6 PEG介导原生质体的转化

2.7 待定转化子继代培养和PCR检测

2.8 转化子分析:

3 结果与分析

3.1 丝轴黑粉菌生长曲线

3.2 影响原生质体制备的因素

3.7 原生质体制备小结

3.8 原生质体再生

3.9 PEG介导的原生质体转化

4 讨论

第三章 ras、gpd启动子的克隆及分析

1 材料

1.1 实验材料

1.2 菌种

1.3 培养基:

1.4 试剂

2.方法

2.1 引物设计

2.2 丝轴黑粉菌孢子的培养与收集

2.3 丝轴黑粉菌基因组DNA的提取

2.4 启动子的PCR扩增

2.5 PCR产物的回收

2.6 目的片段的连接与转化

2.7 重组质粒的鉴定

2.8 DNA测序

3 结果与分析:

3.1 ras与gpd启动子扩增

3.2 重组质粒的鉴定

3.3 启动子序列及其分析

4.讨论

参考文献:

附录

附录1 :丝轴黑粉菌基因组DNA的提取

附录2 :感受态E.coli DH105的制备

附录3 :重组质粒的转化

附录4 :重组质粒的小量提取

附录5 :ras启动子序列同源性比对

附录6 :gpd1启动子序列同源性比对

附录7 :gpd2启动子序列同源性比对

致谢