水稻CDPKs基因的表达谱分析和黑藻Hvppc2转基因水稻的培育和功能分析

摘要

植物钙依赖的蛋白激酶（CDPKs）是细胞体内Ca2+的受体蛋白，在植物生长发育、逆境胁迫反应、病原防御、离子通道运输等信号传导过程中起着重要的作用。本文通过对水稻基因组数据库搜索，共获得31个水稻CDPK基因。通过进化树分析和intron分析，探讨了水稻CDPK基因的进化。利用本室的水稻基因表达谱芯片数据库（CREP：http：//crep．ncpgr．cn），对31个OsCPK基因进行表达谱分析，根据芯片分析结果，对部分特异表达的基因进行Real-time PCR验证。主要研究结果如下：
　　 1．通过对CDPKs保守序列的搜索分析，在水稻基因组中鉴定出31个CDPKs基因，它们具有典型的CDPKs结构域，如Ser/Thr蛋白激酶区、自抑制区、调节区。对OsCPKs进行结构分析，除OsCPK30外，其它的OsCPKs都含有4个EF-手。N-末端可变区序列分析结果表明，21个OsCPKs含有豆蔻酰化位点，28个CDPKs预测含有棕榈酰化位点。
　　 2．大部分OsCPK基因含有5-7个内含子，而OsCPK4、OsCPK-8和OsCPK30含有10-11个内含子，它们同时位于进化分析中的第四亚组：此外，衣藻仅有的2个CDPKs基因也属于第四亚组，说明第四亚组的CDPKs成员可能是最古老的成员。
　　 3．使用Affymetrix芯片检测水稻OsCPK基因在明恢63、珍汕97和汕优63三个水稻品种27个不同表达时期和组织中以及GA3、KT、NAA三种激素处理的表达谱，所有31个OsCPK基因都能在芯片上找到对应的探针，它们都在至少一个检测组织中有表达。
　　 4．OsCPK2、OsCPK11、OsCPK14等8个基因在花粉中特异表达，它们可能在花粉发育中起重要作用。OsCPK7、OsCPK12、OsCPK23等基因在胚乳中高表达，它们可能和种子发育有关。
　　 5．在3种激素处理中，一些OsCPK基因也受它们上调表达，如OsCPK5在这3种激素处理后，表达量都有所上升。
　　 人口不断增长以及可利用耕地的减少，使粮食安全受到前所未有的威胁。因此，改善作物的光合性能，突破产量限制是农业研究的重要研究方向。通过克隆C4植物中C4途径基因，导入水稻，创造C4水稻，已经成为研究热点。单细胞C4植物的存在，是将C3植物改造成C4植物的理论基础。本研究首次将克隆到的单细胞C4植物黑藻的Hvppc2基因的cDNA导入水稻中，并在rbcS启动子驱动下，成功地在水稻中表达，并对转基因植株进行了一系列的光合测定和生理测定。
　　 1．获得的转Hvppc2基因水稻的PEPC酶活是野生型植株酶活的1-4倍，而NADP-ME和PPDK酶活没有改变。
　　 2．PEPC酶活高的转Hvppc2基因植株在高光强下有更高的净光合速率，但转基因植株的暗呼吸和原种没有差异。
　　 3．在PEG-6000模拟干旱胁迫下，转Hvppc2基因植株的脯氨酸含量提高，但可溶性糖含量，MDA含量和SOD活性没有明显改变，说明转Hvppc2基因水稻存在潜在的抗旱能力。
　　 4．在大田种植条件下，除株高相对变矮外，转基因植株的其它农艺性状没有明显改变，和原种相比，单株产量没有差异。

目录

文摘

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论文说明：缩略词表

声明

第一章水稻CDPKs在全生育期和激素处理的表达谱分析

1文献综述

1.1植物钙依赖的蛋白激酶

1.2基因芯片技术在水稻基因表达上的应用

2研究目的和意义

3材料与方法

3.1数据库搜索

3.2基因和蛋白结构分析

3.3进化树分析

3.4芯片表达谱分析

3.5 RNA提取和Real-time PCR

4结果与分析

4.1水稻CDPKs基因的基本信息

4.2进化树分析

4.3 OsCPKs外显子-内含子和模体分析

4.4 OsCPKs基因芯片表达谱分析

4.5 OsCPKs基因在激素(GA3、NAA和KT)处理后的表达分析

5讨论

5.1水稻CDPKs基因分析

5.2水稻OsCPKs的进化

5.3 OsCPKs在种子发育中的作用

5.4 OsCPKs在花粉发育中的作用

5.5 OsCPKs与激素调节

第二章黑藻C4型PEPC基因的克隆及转基因水稻培育和研究

1文献综述

1.1 C3植物、C4植物和CAM植物的光合原理

1.2 C4光合作用的进化

1.3 C4基因对C3植物的转化及其生理影响

1.4高光效基因转化存在的问题

2本研究的目的和意义

3材料与方法

3.1实验材料

3.2目的基因

3.3实验所用到的菌株和载体

3.4 Hvppc2基因的克隆

3.5超表达载体构建

3.6水稻愈伤诱导和遗传转化

3.7转基因植株PCR检测

3.8转基因植株拷贝数分析及表达量检测

3.9转基因水稻叶片PEPC、NADP-ME、PPDK酶活性的测定

3.10光合生理测定

3.11模拟干旱条件下转基因植株的生理测定

3.12主要农艺性状的考察

4.结果与分析

4.1 Hvppc2基因的克隆分析

4.2 Hvppc2超表达植株的获得及分子检测

4.3 pR1300-hvppc2转基因植株的酶活测定

4.4 pR1300-hvppc2转基因植株的气体交换参数测定

4.5叶绿素荧光特性的初步测定

4.6叶绿素含量比较

4.7模拟干旱条件下转基因植株的生理测定

4.8转Hvppc2基因水稻农艺性状考察

5讨论

5.1高表达Hvppc2基因水稻有更好的光合能力

5.2高表达Hvppc2基因水稻有潜在的耐旱能力

5.3转Hvppc2基因水稻农艺性状考察

5.4后续工作探讨

5.5小结与展望

参考文献

致谢

附录