1型鸭肝炎病毒VP0基因表达及重组蛋白ELISA方法的建立

摘要

鸭肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus, DHV)是一种无囊膜的病毒,其结构蛋白与病毒在宿主体内的侵染和复制密切相关。研究已发现DHV-1中结构蛋白VP1基因两端的高度可变不仅是区别与其他小RNA病毒的基础,也是不同类型DHV毒力差异的原因。而结构蛋白VP0相对保守。根据亲缘关系最近的人双埃柯病毒(Human Parechovirus,HPeV)的研究,推测DHV-1结构蛋白VP0上可能存在保守的B细胞表位,即产生中和抗体的抗原表位。利用结构蛋白VP0为包被抗原建立的ELISA方法可以广泛的识别各株DHV-1产生的血清抗体,如果制备成商业化试剂盒,将具有广泛的应用前景。本研究通过分子生物学方法表达了DHV-1结构蛋白VP0,并建立了检测DHV-1血清抗体间接ELISA方法,主要完成以下研究工作。
　　(1)将DHV-1的VP0基因克隆入原核表达载体pGEX-KG,构建原核表达质粒pGEX-KG-VPO,使其在E.coli BL21(DE3)中成功表达。对表达产物进行SDS-PAGE分析,目的蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在。分别对其进行纯化,得到了纯化后的蛋白,为下一步的研究奠定了基础。
　　(2)将纯化的重组蛋白作为包被抗原,分别建立了可溶性VP0间接ELISA和包涵体VP0间接ELISA方法,并对ELISA的反应条件进行了摸索。确定可溶性VP0间接ELISA方法的抗原最佳包被浓度为4μg/mL,最佳包被条件为37℃3h,4℃过夜,血清最佳稀释度为1:40,HRP标记的兔抗鸭IgY最佳工作浓度为1:8000,最佳工作时间为40min;包涵体VP0间接ELISA方法的抗原最佳包被浓度为8μg/mL,最佳包被条件为37℃3h,4℃过夜,血清最佳稀释度为1:40,HRP标记的兔抗鸭IgY最佳工作浓度为1:8000,最佳工作时间为40min。两种方法包被的重组蛋白均不与禽流感、鸭瘟、呼肠孤与鸭疫里默氏杆菌病的阳性血清发生交叉反应,表明建立的ELISA方法具有良好的特异性。同时,与病毒间接ELISA方法进行了平行比较,检测了978份血清样品。可溶性VPO-ELISA和病毒-ELISA两种方法的kappa值为0.898,包涵体VP0蛋白-ELISA和病毒-ELISA两种方法的kappa值为0.763。当kappa值为0.6以上时两种方法的一致性相当可靠,所以本研究所建立的重组蛋白VP0间接ELISA方法具有相当的可信度。
　　(3)对湖北省,河南省部分血清样品进行了检测。其中,湖北省的114份血清样品中,病毒-ELISA方法阳性检出率为87％,可溶性VPO-ELISA方法阳性检出率为90％。河南省的60份血清样品中,病毒-ELISA方法阳性检出率为90％,可溶性VPO-ELISA方法阳性检出率为88％。

目录

摘要

Abstract

缩略词表

第一章 文献综述

1 DHV-1的病原学研究进展

1.1 DHV-1致病特点

1.2 DHV-1的分子生物学结构

2 DHV-1检测方法研究进展

2.1 中和试验

2.2 酶联免疫吸附试验

2.3 琼脂扩散试验

2.4 凝集试验

2.5 胶体金技术

2.6 分子生物学方法

3 研究的目的与意义

第二章 DHV-1JX株结构蛋白VP0基因的原核表达、纯化以及间接ELISA方法的建立

1 试验材料

1.1 试验动物

1.2 毒株、基因和血清

1.3 质粒及菌株

1.4 主要试剂与器材

1.5 主要仪器设备

1.6 主要溶液及其配制

2 方法

2.1 1型鸭肝炎弱毒的增殖、纯化与DHV-1间接ELISA方法的建立

2.2 重组表达质粒的构建

2.3 重组表达质粒在E.coli BL21(DE3)菌中的诱导表达及检测

2.4 可溶性VP0以及包涵体VP0间接ELISA方法的建立

2.5 间接ELISA方法检测血清抗体的应用

3 结果与分析

3.1 1型鸭肝炎弱毒病毒的浓度鉴定

3.2 DHV-1间接ELISA方法的建立

3.3 重组表达质粒的PCR鉴定和酶切鉴定

3.4 序列测定

3.5 VP0的表达及SDS-PAGE分析

3.6 VP0蛋白的可溶性分析

3.7 包涵体蛋白和可溶性蛋白的纯化与浓度的测定

3.8 可溶性VP0以及包涵体VP0间接ELISA方法的建立

3.9 间接ELISA方法检测血清抗体的应用

4. 讨论

4.1 表达载体的选择以及重组表达质粒在E.coliBL21中的诱导表达

4.2 可溶性VP0的纯化

4.3 间接ELISA方法的建立

4.5 重组蛋白VP0-ELISA方法与病毒-ELISA方法的比较

4.6 建立的可溶性VP0-ELISA、包涵体VP0-ELISA和病毒-ELISA方法的应用

结论

参考文献

致谢