根癌农杆菌介导的CG1-400-RNase和绿色荧光蛋白基因转化椪柑的研究

摘要

优质无核柑橘品种选育是柑橘品种改良的重要目标。而常规育种由于受珠心胚、性器官败育、童期长、遗传上高度杂合等生物或遗传学特性的干扰,进程较为缓慢。近年来,不断发展的转基因技术以及与种子发育相关基因的发掘为柑橘无核新品种选育提供了快捷有效的途径。本研究以特色多核品种椪柑作为改良目标,以其实生苗上胚轴切段和根轴联结体为外植体,以农杆菌介导法转入导致种子败育的基因CG1-400-RNase,以期创造椪柑无核新种质;同时将绿色荧光蛋白基因(Green fluorescent protein gene, GFP)转入椪柑,获得了稳定表达绿色荧光的抗性芽。主要研究结果如下:1.椪柑实生苗上胚轴切段和根轴联结体转化CG1-400-RNase基因。上胚轴切段和根轴联结体的再生率分别为17.1％和11.4％。对获得的抗性芽进行初次PCR检测,有40个不定芽为阳性,抗性芽的阳性率为12.86％,转化率为0.55％;将阳性芽进行试管嫁接培养获得15株完整植株,但后期PCR检测未获得阳性植株,表明椪柑遗传转化的难度较大。2.椪柑实生苗上胚轴切段和根轴联结体转化GFP基因。上胚轴切段和根轴联结体再生率分别为20.6％和21.4％,均高于转化无核基因的再生率,表明相同基因型经转化不同基因载体后不定芽再生率有一定的差异。通过荧光显微镜活体观察得到稳定表达绿色荧光蛋白的抗性芽24个,其中有7个嵌合体;上胚轴切段和根轴连结体的转化率分别为4.1％和1.3％,嵌合率为29.2％。

目录

摘要

Abstract

缩略词表

1 前言

1.1 课题的提出

1.2 柑橘遗传转化研究进展

1.3 柑橘无核机理

1.4 传统选育无核柑橘的方法

1.5 无核育种的新策略

1.5.1 原生质体融合技术的应用

1.5.2 基因工程创造无核柑橘

1.8 GFP荧光蛋白的研究

1.8.1 GFP的概况

1.8.2 GFP的应用

1.9 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 转化受体材料

2.1.2 农杆菌菌株和质粒

2.1.3 转化所用培养基配方

2.1.4 主要生化试剂

2.2 实验方法

2.2.1 质粒DNA的抽提(碱裂解法)

2.2.2 根癌农杆菌介导的柑橘遗传转化

2.2.3 GFP检测

2.2.4 柑橘基因组DNA提取

2.2.5 PCR检测

3 结果与分析

3.1 以实生苗上胚轴切段和根轴联结体为外植体的CG1-400-RNASE基因的遗传转化

3.1.1 椪柑实生苗上胚轴切段和根轴联结体的转化再生

3.1.2 再生率与转化率统计

3.1.3 转基因植株的PCR鉴定

3.2 以实生苗上胚轴切段和根轴联结体为外植体的GFP基因的遗传转化

3.2.1 椪柑实生苗上胚轴切段和根轴联结体的转化再生

3.2.2 抗性芽的荧光检测

3.2.3 再生率和转化率评价

4 讨论

4.1 影响农杆菌介导的椪柑的遗传转化的因素

4.1.1 基因型的影响

4.1.2 外植体状态的影响

4.1.3 适宜的再生和培养方式

4.2 GFP在遗传转化中的应用

参考文献

致谢