PtCBF转化枳和椪柑及在枳和椪柑内的时空表达

摘要

柑橘经常受到冻害、干旱、盐碱等环境因素的胁迫,严重阻碍了柑橘业的健康发展。因此,研究植物对环境胁迫的应答机制,利用基因工程手段提高植物的抗逆性,已成为柑橘业发展的关键性工作。
　　 CBF(C-repeat binding factor)是调控一系列植物冷驯化相关基因表达的转录因子,被低温诱导表达,与相应顺式作用元件CRT/DRE(C-repeat/dehydrationresponsive element)结合,诱导冷相关基因的表达,进而合成抗寒相关的糖类、脯氨酸和膜稳定蛋白等物质,提高植物的抗寒性。因此,利用CBF转化柑橘有望成为培育柑橘抗寒新品种的有效途径。
　　 本实验室前人已经构建好CBF-GFP融合基因的农杆菌表达载体CG2301。本试验旨将已经构建好的表达载体CG2301通过农杆菌介导转入枳(Poncirus trifoliata(L.)Raf.)和椪柑(Citrus reticulata Blanc)。低温处理转基因植株,在荧光显微镜下检测转基因苗的时空表达。
　　 主要试验结果如下:
　　 1)CG2301的亚细胞定位:通过基因枪介导转化洋葱表皮细胞,荧光显微镜下检测,荧光集中在细胞核上,表明PtCBF定位于细胞核。
　　 2)转基因苗的获得:融合基因表达载体CG2301通过农杆菌介导转入枳和椪柑,获得转基因苗,其中一些转基因苗进行了盆栽和扩繁。
　　 3)CBF基因的空间表达:4℃处理转基因枳,根部比较敏感,15min后发出较强荧光,而茎部和叶片背面发出较弱荧光。随着处理时间的加长,叶片,茎部荧光表达逐渐增强,叶片正面的翼叶和三片复叶的连接处、叶柄和茎的连接处及幼叶的荧光表达较强。转基因枳荧光发光部位并不是机械的均一,本试验中并未发现整个植株或整个叶片全部发光的现象。荧光表达多发生在根、叶片等组织较薄的地方,而茎部表达相对较少。抗寒性较枳壳弱的椪柑4℃处理后,有少量绿色荧光产生。其中,叶片背面主脉处、茎部荧光表达较强。
　　 4)CBF基因的时间表达:枳转基因幼苗的荧光表达随着处理时间的加长呈现“强－弱－强”的规律。幼苗在4℃处理15min后,已有荧光发生,随着处理时间的加长,荧光表达加强,并在几小时内(2 h、4 h、8 h)保持着较高水平。但在16 h处理后,荧光表达反而变弱。随着冷处理时间的继续加长,荧光表达又开始加强(20 h)。24h和48 h时荧光表达持续增强。抗寒性较枳壳弱的椪柑的荧光强度变化与处理时间长短的关系不明显。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表(ABBREVIATIONS)

第一章 论文综述与研究意义

1 研究的目的和意义

1.1 研究意义

1.2 研究目的

1.3 技术路线

2 文献综述

2.1 植物抗寒研究进展

2.2 GFP在植物分子生物学领域的应用

第二章 CBF-GFP融合基因的亚细胞定位

1 材料与试剂

1.1 转化受体材料

1.2 供试农杆菌菌株和质粒

1.3 主要试剂

2 方法

2.1 洋葱表皮细胞的培养

2.2 质粒提取(碱裂解法)

2.3 金粉准备

2.4 微弹制备

2.5 基因枪的准备

2.6 基因枪的轰击

2.7 洋葱表皮镜检

3 结果与分析

4 讨论

第三章 枳、椪柑的遗传转化

1 材料与试剂

1.1 植物材料

1.2 菌株与质粒

1.3 主要试剂

1.4 培养基

2 方法

2.1 根癌农杆菌介导的枳、桠柑遗传转化的实验

2.2 枳再生苗的扩繁

2.3 转基因植株的验证

3 结果与分析

3.1 枳遗传转化过程

3.2 桠柑的遗传转化过程

3.3 枳再生苗扩繁的分析

3.4 枳试管苗上胚轴与枳再生苗上胚轴新芽诱导的比较分析

3.5 转基因材料的鉴定

4 问题与讨论

4.1 枳、碰柑遗传转化过程中存在的问题

4.2 柑橘转基因材料获得的难题

4.3 遗传转化受体材料的选择

4.4 转基因植株的扩繁

第四章 CBF在枳和椪柑中的时空表达

1 材料

2 方法

3 转基因植株的CBF时空表达结果与分析

3.1 CBF在转基因枳中的时空表达

3.2 CBF在转基因桠柑中的时空表达

3.3 荧光显微镜下非转基因枳的发光情况

4 问题与讨论

4.1 CBF在转基因枳中的时空表达

4.2 CBF在转基因椪柑中的时空表达

4.3 GFP检测的优越性

4.4 GFP检测存在的问题

4.5 下一步可以开展的工作

参考文献

附录

附录一 CBF-GFP融合基因的亚细胞定位

附录二 枳遗传转化

附录三 椪遗传转化

附录四 再生枳的扩繁

附录五 CBF在转基因枳中的时空表达

附录六 CBF在转基因椪柑中的时空表达

附录七 荧光显微镜下非转基因枳的发光情况

致谢