不同毒力的牛分枝杆菌诱导树突状细胞凋亡的研究

摘要

牛结核病是由分枝杆菌引起的一种慢性消耗性人兽共患传染病,可以引起包括人和家畜以及野生动物发病的疾病,被国际动物卫生组织(OIE)定为B类传染病。”全球每年因结核病而使畜牧业产生的直接经济损失约为30亿美元。据统计,全世界约10％以上的人结核病是由牛分枝杆菌病原引起的。牛结核病给畜牧业的发展和人类健康带来重大影响,也同时成为世界性的公共卫生问题。鉴于牛结核病检测方法的不稳定性和疫苗的低保护力,研究牛分枝杆菌的致病机制势在必行。深入探讨牛结核分枝杆菌的致病机制,可以为牛结核的新型诊断方法和疫苗提供更多的理论依据和指导。
　　牛分枝杆菌是细胞内寄生菌,因此细胞免疫和结核病的致病过程密切相关。而树突状细胞是牛分枝杆菌的宿主细胞之一。树突状细胞是目前发现的抗原递呈最强大,唯一在体内可以激活初始性T淋巴细胞的抗原递呈细胞。应用树突状细胞作为牛分枝杆菌的模式细胞,对于研究牛结核的致病机制有重大意义。细胞凋亡也称细胞程序性死亡,是由基因控制的细胞主动死亡的过程。通过细胞凋亡,机体可以清除损伤的细胞或者受病原微生物感染的细胞,以维持机体内环境的相对稳定。
　　本实验室基因芯片结果显示,不同毒力的牛分枝杆菌可以引起树突状细胞不同程度的凋亡,且毒力型牛分枝杆菌引起的树突状细胞的凋亡比卡介苗程度要低。我们应用流式细胞术分析,酶联免疫吸附试验测定DNA片段化,荧光定量PCR, Western blot,通过荧光显微镜观察凋亡细胞的核形态等方法检测树突状细胞凋亡的情况。
　　因此,本课题研究从牛分枝杆菌与树突状细胞的相互作用进行细胞凋亡的初步探讨,主要获得以下结果:
　　1.流式细胞术检测感染树突状细胞细胞的凋亡树突状细胞在感染牛分枝杆菌后,应用PI法通过流式细胞仪测定感染后的树突状细胞的DNA含量变化。流式细胞术结果显示牛分支杆菌弱毒株BCG感染DCs后出现较高的亚二倍体峰,即毒力型牛分支杆菌抑制了DCs的凋亡。经统计学分析后显示,BCG感染组的细胞凋亡率是毒力型牛分支杆菌感染组凋亡率的2.5倍,t检验显示两组数据间差异极其显著(P＜0.001)。
　　2.DNA片段化测定感染树突状细胞细胞的凋亡应用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定感染牛分支杆菌后DCsDNA片段化的程度。ELISA结果显示相对于毒力型牛分支杆菌感染组,牛分支杆菌弱毒株BCG感染DCs后细胞质内DNA片段化程度要高。统计学分析显示BCG感染组的细胞凋亡率是毒力型牛分支杆菌感染组凋亡率的1.55倍,t检验显示两组数据间差异极显著(P＜0.01),即卡介苗可以比毒力型牛分支杆菌引起更高程度的细胞凋亡。
　　3.荧光定量PCR检测凋亡相关基因的相对表达情况在荧光定量PCR中,我们选定caspase3, caspase8, caspase9和Dffa基因为目标基因,以β-actin为参照基因,相对于毒力型牛分枝杆菌感染组,卡介苗感染组的树突状细胞的caspase3, caspase8, caspase9,和Dffa基因的表达成上调趋势。其中caspase3, caspase9两个基因上调的倍数均在2.5倍以上,而BCG感染组DCs的caspase8和Dffa基因分别是毒力型牛分枝杆菌感染组DCs相关基因的1.2倍-1.3倍左右。Dffa基因上调倍数结果和芯片结果基本抑制,芯片结果显示相对于毒力型牛分支杆菌,BCG感染组DCs中Dffa基因上调了约0.5倍。凋亡相关基因的上调也再次证明了毒力型牛分枝杆菌抑制了树突状细胞的凋亡,而且由于caspase9基因上调倍数较大,caspase9是内源性细胞凋亡的主要参与基因,因此推测内源性细胞凋亡可能参与了BCG引起的DCs凋亡,相关验证试验正在继续。
　　4. Western blot检测凋亡相关基因的表达相对于空白组细胞,BCG和毒力型牛分枝杆菌感染的树突状细胞的caspase8,9在蛋白水平都有所上调。相对于毒力型牛分枝杆菌感染组细胞,BCG感染组的caspase8,9基因在蛋白水平表达都呈上调趋势。也就是BCG和毒力型牛分枝杆菌都引起了树突状细胞的凋亡,而且毒力型牛分枝杆菌抑制了树突状细胞的凋亡。并且相对于空白组细胞,牛分枝杆菌感染组树突状细胞的caspase9在蛋白水平比caspase8上调的要多,因此推测牛分枝杆菌诱导的树突状细胞凋亡以内源性细胞凋亡为主。
　　5.树突状状细胞核形态的评估应用核酸染料Hoechst33342对感染牛分支杆菌的DCs进行染色,发现作为细胞凋亡的典型特征之一的细胞皱缩和核凝聚现象也在本实验中被观察到。
　　6.树突状细胞感染结核菌后相关细胞因子的表达应用ELISA检测试剂盒检测被感染的树突状细胞分泌细胞因子水平的变化情况,包括IL-1, IL-10, IL-12, TNF-α等。感染毒力型牛分枝杆菌的树突状细胞分泌IL-10和感染BCG的树突状细胞IL-10分泌量差异不大。感染BCG的树突状细胞分泌TNF-α的量是感染毒力型牛分枝杆菌感染组分泌量的1.6倍,IL-10, TNF-α相关数据经过统计学分析后分别为P＞0.05和P＜0.01,差异程度分别为IL-10差异不显著和TNF-α差异极显著。感染毒力型牛分枝杆菌的树突状细胞分泌IL-1,IL-12的量是感染BCG的树突状细胞分泌量的2倍和1.3倍。IL-1和IL-12数据经过统计学分析后分别为P＜0.01和P＜0.05,差异程度分别为IL-1差异极显著和IL-12差异显著。

目录

摘要

ABSTRACT

1. 文献综述

前言

1.1 细胞凋亡的研究进展

1.1.1 细胞凋亡的概念

1.1.2 细胞凋亡与机体免疫

1.1.3 细胞凋亡的生物学特征及检测方法

1.1.4 细胞凋亡的信号通路及相关调控基因

1.2 结核分支杆菌与细胞凋亡

1.2.1 结核病病原及其宿主细胞

1.2.2 caspase与结核分支杆菌诱导的细胞凋亡

1.2.3 结核分枝杆菌相关蛋白和细胞凋亡的研究

1.2.4 结核分枝杆菌相关蛋白和细胞凋亡的研究

1.2.5 高毒力结核分枝杆菌抑制细胞凋亡

1.3 树突状细胞凋亡的生物学意义

1.3.1 树突状细胞的生物学特性

1.3.2 免疫细胞和结核分支杆菌相互作用的研究

1.3.3 树突状细胞凋亡的相关研究

1.3.4 树突状细胞凋亡的生物学意义

2. 研究目的与意义

3. 材料与方法

3.1 实验材料

3.1.1 菌种及实验动物

3.1.2 细胞

3.1.3 培养基

3.1.4 荧光定量PCR相关引物

3.1.5 主要试剂

3.2 标准菌株的培养计数

3.3 树突状细胞的培养与鉴定

3.3.1 树突状细胞的培养

3.3.2 树突状细胞的鉴定

3.4 树突状细胞细菌感染实验

3.5 树突状细胞凋亡检测

3.5.1 流式细胞仪测定细胞周期

3.5.2 ELISA检测DNA片段化

3.5.3 Real time PCR检测凋亡相关基因的转录水平表达情况

3.5.4 Western Blot检测部分凋亡蛋白

3.5.5 凋亡细胞的核形态评估

3.6 树突状细胞感染后细胞因子的表达

4. 结果

4.1 树突状细胞分化与纯度鉴定

4.2 细胞周期测定分析树突状细胞凋亡

4.3 ELISA检测DNA片段化评价树突状细胞细胞凋亡

4.4 Real time PCR检测凋亡相关基因的转录水平表达情况

4.5 Western Blot检测部分凋亡蛋白

4.6 树突状细胞凋亡的细胞核形态评估

4.7 细胞因子的表达

5. 讨论

5.1 未成熟树突状细胞的培养

5.2 感染用标准菌株的培养和计数

5.3 不同毒力的牛分支杆菌诱导树突状细胞凋亡的结果比较与分析

5.4 牛分支杆菌诱导DCs凋亡差异与结核病致病机理的之间的关系

5.5 不同毒力的牛分支杆菌诱导树突状细胞凋亡信号通路的初步探讨

5.6 感染不同毒力的牛分支杆菌后树突状细胞分泌细胞因子的情况

6. 结论

参考文献

致谢