NADPH氧化酶在牛分枝杆菌诱导树突状细胞凋亡中的作用

摘要

结核病是由结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis Complex）引起的一种重要的慢性消耗性人兽共患疾病。结核病在世界范围内造成的危害非常巨大。牛分枝杆菌是结核分枝杆菌复合群的重要成员之一，不仅会导致人的结核病，同时也对养牛业造成重大危害。想要持续稳定地控制甚至根除结核病，必须依靠新疫苗、诊断方法以及新的抗结核药物的开发和运用，而其中的一个先决条件是弄清楚结核分枝杆菌与机体免疫系统中多种细胞之间的关联。
　　树突状细胞在机体免疫中扮演重要作用，是机体内功能最强大的抗原提呈细胞。同时，树突状细胞也是牛分枝杆菌的主要宿主细胞之一。此外，卡介苗作为牛分枝杆菌的弱毒株，能够刺激机体产生免疫反应，但并不会引起病理变化和持续感染。因此，以树突状细胞为模式细胞，以牛分枝杆菌和卡介苗为模式菌，研究牛分枝杆菌的致病机理具有非常重要的作用。
　　细胞凋亡是机体重要的免疫机制。实验室之前的研究表明，牛分枝杆菌和卡介苗能够引起树突状细胞不同水平的凋亡，但引起凋亡的具体机制有待进一步研究。细胞内活性氧的水平对细胞凋亡有着明显的影响，同时NADPH氧化酶是细胞内产生活性氧的主要酶之一。本研究试图通过调查树突状细胞感染不同毒力分枝杆菌后，细胞内活性氧水平差异与细胞凋亡水平差异之间的关联，揭示牛分枝杆菌和卡介苗诱导树突状细胞不同程度凋亡的深层原因，进而理解牛分枝杆菌免疫逃避机制。主要内容如下：
　　1.NADPH氧化酶是树突状细胞感染不同毒力分枝杆菌后产生细胞内活性氧的主要酶。
　　本研究分别用牛分枝杆菌和卡介苗感染树突状细胞，在感染前的3h分别加入细胞内产生活性氧7种主要氧化酶的抑制剂，在感染后的1h、6h和24h三个时间点检测细胞内活性氧的水平。在未加抑制剂的对照组中，M.bovis感染组细胞内活性氧的产生水平明显高于BCG感染组；而在加入抑制剂的7个组，NADPH氧化酶抑制剂对细胞内活性氧的抑制作用要明显强于其他抑制剂，说明NADPH氧化酶是树突状细胞感染不同毒力分枝杆菌后产生细胞内活性氧的主要酶体。
　　2.荧光定量检测PCR检测NADPH氧化酶各亚基的相对表达量
　　牛分枝杆菌和卡介苗分别感染树突状细胞后，在1h、6h和24h三个时间点取样，用荧光定量检测Nox2、gp22phox、gp47phox以及gp67phox4个亚基的相对表达量。结果显示：牛分枝杆菌感染组gp22phox、gp47phox以及gp67phox等三个亚基在三个时间点的表达量高于卡介苗感染组；牛分枝杆菌感染组Nox2亚基在1h和6h的表达量与BCG感染组基本相等，而在24h处，卡介苗感染组略高于牛分枝杆菌感染组。
　　3.Western blot检测Nox2亚基的蛋白表达量
　　Western blot检测空白组、卡介苗感染组以及牛分枝杆菌感染组在1h、6h以及24h三个时间点的Nox2亚基的蛋白表达水平。结果显示，牛分枝杆菌感染组在1h和6h的表达量略高于卡介苗感染组，而在24h,二者的表达量相当。
　　4.TUNEL法检测树突状细胞的凋亡
　　在感染前3h加入了NADPH氧化酶抑制剂DPI，将细胞分为加抑制剂组和不加抑制剂组，然后分别用BCG以及M.bovis感染树突状细胞，并在感染后的1h、6h和24h三个时间点收集细胞，用TUNEL法检测凋亡。结果显示：加入抑制剂后能够很明显的抑制分枝杆菌感染引起的树突状细胞的凋亡，说明NADPH氧化酶树突状细胞凋亡中的作用。
　　5.Western blot检测片段化的caspase-9
　　在感染前3h加入了NADPH氧化酶抑制剂，感染后24h收集细胞，用western blot检测片段化的caspase-9，结果显示：抑制剂能够很好的抑制caspase-9的活化，进一步说明NADPH氧化酶在不同毒力分枝杆菌诱导树突状细胞凋亡中的重要作用。

目录

声明

1.文献综述

1.1 结核分枝杆菌与机体免疫

1.2 树突状细胞与结核免疫

1.3 NADPH氧化酶介导树突状细胞产生活性氧

2. 研究目的和意义

3. 材料和方法

3.1 材料

3.2 牛分枝杆菌与卡介苗的培养及计数

3.3树突状细胞的培养与鉴定

3.4树突状细胞的分枝杆菌感染实验

3.5 细胞内活性氧水平的检测

3.6 荧光定量检测NADPH氧化酶各亚基的转录水平

3.7 Western Blot检测NOX2 亚基蛋白表达水平

3.7 树突状细胞凋亡的检测

4.结果

4.1树突状细胞的纯度与成熟状态的鉴定

4.2细胞内活性氧水平的检测情况

4.3荧光定量PCR检测NADPH氧化酶各亚基的mRNA表达情况

4.4 Western Blot检测NOX-2亚基的表达水平

4.5树突状细胞凋亡情况

5.讨论

5.1 未成熟树突状细胞的培养条件的优化

5.2 NADPH氧化酶在树突状细胞内活性氧产生的作用

5.3树突状细胞中NADPH氧化酶的表达

5.4 NADPH氧化酶在树突状细胞凋亡通路中的作用

6． 结论

参考文献

附录

致谢