猪APC家族3个基因克隆鉴定、转录调控及与性状关联分析研究

摘要

促后期复合物(anaphase promoting complex,APC)是一种与细胞周期相关的泛素连接酶,可通过泛素--蛋白酶体途径降解与有丝分裂相关的调节因子,以保证有丝分裂的有序进行和适时退出。APC通过降解securin,促进细胞从分裂中期向后期转化；通过降解cyclinB,促进细胞退出本次有丝分裂,向下个周期的G1期转化。APC的活性受阻时有丝分裂纺锤体检测点活性会增加,这提示APC的失调会导致染色体不稳定。由于人类大多数恶性癌变均表现出染色体的增减,所以染色体不稳定被认为是恶性病变的因为。而且一些APC作用的靶分子,比如securin、polo-likekinase、aurora kinase和SnoN,已被证明是致癌基因。因此APC的失调可能与肿瘤的发生相关。
　　 哺乳动物的APC家族至少有11种核心蛋白亚基。本试验克隆了猪的APC7、APC10和APC133个基因的部分cDNA、内含子和5’侧翼端(启动子区域)序列,对它们在猪各器官的表达、在不同物种中的进化关系进行了分析。寻找和鉴定了猪APC7和APC13基因组序列中的若干SNPs位点和InDels位点,与一系列生长和免疫性状进行了关联分析,为进一步研究该家族基因的作用奠定了基础,并为其将来运用于标记辅助育种提供了依据。另外,本试验对猪APC7和APC10基因启动子区域的活性以及转录因子Sp1蛋白与猪APC7、APC10和APC133个基因的互作做了初步的研究,主要研究结果如下:
　　 (1)以人同源基因的cDNA序列为探针,从GenBank中搜索猪的同源性大于80％的EST序列,以EST构成的连接群设计引物,从猪的基因组中分离克隆了APC7、APC10和APC13基因的完整编码区序列(coding sequence,CDS)和部分基因组序列。对此3个基因的mRNA以及蛋白预测序列序列进行了物种同源基因序列比对分析。结果显示这3个基因在种内和种间都是相当保守的。
　　 (2)利用实时定量PCR技术检测了APC7、APC10和APC13基因在猪不同器官组织中的表达情况,探明了猪APC7、APC10和APC13基因的组织表达规律。结果发现在检测的成年五指山猪心脏、肝脏、脾、肺、肾、骨骼肌、淋巴结、胸腺等器官内均有表达,且各器官间的表达水平差异较小。
　　 (3)在中外猪群中利用PCR-RFLP、AS-PCR等方法分别对猪APC7的2个SNPs位点和2个Indels位点以及APC13基因的1个Indel位点进行了判型,结果发现中外猪种在这些多态位点的基因频率上表现出较大差异。
　　 (4)将发现的SNPs位点和Indels位点基因型与温氏(长白)试验猪群的生长形状和免疫性状进行了关联分析。结果显示猪APC7基因第4内含子上SNP(A/G)位点与血小板计数显著相关(P值为0.0427)；第5内含子上SNP(T/G)位点与32日龄仔猪血小板分布宽度、平均血小板容积和大血小板细胞比率显著相关(P值分别为0.0175,0.0383和0.0213)；启动子区域InDel(45bp)不同的基因型在初生重存在显著性差异(P<0.05),在断奶重存在极显著差异(P<0.01)。而猪APC13基因第1内含子上InDel(TGC)与17日龄仔猪的绝对淋巴细胞计数和32日龄仔猪红细胞平均血红蛋白浓度显著相关(P值分别为0.0457和0.0455)。
　　 (5)采用热不对称交错聚合酶链式反应(Tail-PCR)技术克隆得到了猪APC7、APC10和APC13基因的5’侧翼端(启动子区域)序列,利用启动子分析软件TESS对基因启动子中可能的调控元件进行了预测,然后构建了猪APC7和APC10基因启动子区域的各种5’端缺失突变的报告基因载体进行转染,荧光素酶试验显示了各段截短体的启动子活性。同时结果显示了猪APC7基因启动子区InDel(45bp)和InDel(29bp)对启动子活性的抑制作用。
　　 (6)采用酵母单杂交试验初步验证了猪APC7、APC10和APC13基因的近启动子序列可与转录因子Sp1互作。另外,APC13基因的第1内含子也可与Sp1互作。

目录

文摘

英文文摘

基金项目

缩略词表

1 文献综述

1.1 细胞周期及其关键的调控因子

1.1.1 细胞周期概述

1.1.2 细胞周期调控过程中的关键大分子

1.1.3 细胞周期调控中的监控--“检测点”(checkpoint)机制

1.2 泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)

1.3 APC的组成及在细胞周期和肿瘤发生中的作用

1.3.1 APC的组成

1.3.2 APC在细胞周期和肿瘤发生中的作用

2 本研究的目的和意义

3 材料与方法

3.1 材料

3.1.1 样品

3.1.2 载体和菌株

3.1.3 试剂盒,酶,血清

3.1.4 主要试剂及配制

3.1.5 主要仪器设备

3.1.6 主要分子生物学软件

3.1.7 主要数据库

3.2 方法

3.2.1 目的基因cDNA序列的分离方法

3.2.2 基因基因组序列的分离方法

3.2.3 蛋白质多序列比对和系统进化树的绘制

3.2.4 目的基因表达谱分析

3.2.5 启动子活性鉴定

3.2.6 目的基因的多态性检测

3.2.7 猪基因与性状的关联分析

3.2.8 酵母单杂交试验

3.3 本研究的试验总体方案

4 结果与分析

4.1 猪APC7、APC10和APC13基因的分离

4.1.1 猪APC7、APC10和APC13基因的序列分析

4.1.2 猪APC7、APC10和APC13蛋白的多序列对比和特征预测

4.1.3 APC7、APC10和APC13亚基蛋白的进化分析

4.1.4 猪APC7、APC10和APC13基因的组织表达分析

4.1.5 猪APC7、APC10和APC13的基因组序列

4.2 猪APC7和APC13基因的核苷酸多态性检测与关联分析

4.2.1 猪APC7基因的核苷酸多态性检测与关联分析

4.2.2 猪APC13基因的核苷酸多态性检测与关联分析

4.3 基因启动子活性检测

4.3.1 猪APC7基因启动子区域的活性以及核苷酸序列插入缺失突变((InDel(45bp)和InDel(29bp))对启动子活性的影响

4.3.2 猪APC10基因启动子区域的活性

4.4 酵母单杂交试验

4.4.1 猪APC7基因与Sp1蛋白的互作

4.4.2 猪APC10基因与Sp1蛋白的互作

4.4.3 猪APC13基因与Sp1蛋白的互作

5 讨论

5.1 在进化上的保守

5.2 APC各亚基功能的多样性

5.3 启动子活性分析

5.4 酵母单杂交

全文结论

本研究的创新点与特色

下一步的研究计划

参考文献

附表

附图

在读期间发表和完成的论文题录

已申请的专利

致谢