大蒜白斑病病原学、防治技术及其毒素致病机理研究

摘要

大蒜白斑病是近年来在湖北省当阳地区发现的一种毁灭性病害。自2005年以来,该病在当阳市10万亩大蒜生产区大面积发生,年均减产20％～70％,严重影响了大蒜的产量和品质。本文通过形态学和分子生物学方法将大蒜白斑病病原鉴定为茄匍柄霉Stemphylium solani。在此基础上进一步对大蒜白斑病的病原学、防治技术以及毒素作用机理进行了研究。主要研究结果如下:
　　 1.从湖北省当阳市大蒜种植基地采集具有典型症状的病叶,用常规组织分离法获得Stemphylium sp.菌株31个,Alternaria sp.菌株33个。从每种菌中选取代表性菌株进行致病性测定,结果表明,分别用Stemphylium sp.菌株DY-1、DY-5和DY-6的菌丝块或分生孢子悬浮液接种,叶片发病率均为100％；而用Alternaria sp.菌株DY-P-1和DY-W-1的菌丝块或分生孢子悬浮液接种大蒜叶片,均未表现任何症状。菌株DY-1、DY-5和DY-6的形态学特征相似,在PSA平板上分生孢子褐色,具1-3个横隔膜,中间隔膜颜色较深,有2-7个纵(斜)隔膜,大小29-58(45)×14-28(22)μm,长宽比为2:1；分生孢子梗顶端囊状膨大,长达169μm；经产孢表型培养,可观察到分生孢子以内壁芽生式从产孢梗的顶端囊状膨大体处产生；在自然寄主上,分生孢子大小为27-48(39)×15.30(21)μm；参照Simmons和Ellis等的分类方法,将菌株DY-1、DY-5和DY-6鉴定为茄匍柄霉S.solani。rDNA-ITS序列分析结果表明,3个供试菌株的5.8S rDNA及两侧的ITS区序列与S.solani的同源性达99％。采用neighbor-ioining法构建匍柄霉不同种的系统发育树,发现菌株DY-1、DY-5和DY-6的序列与GenBank中S.solani(AF203449、AF203450)、S.nabarii(AY372679)和S.subglobuliferum(AY751454)的遗传距离最近。
　　 2.采用测定菌丝生长情况对大蒜白斑病菌生物学特性进行研究。结果表明,菌株DY-5在PSA平板上培养,5～35℃范围内均能生长,最适生长温度为20～30℃,pH值4～10均可生长,pn值为6～8时生长最佳；在Czapek液体培养基中培养,病菌对测试碳源中淀粉的利用效果最好,而对甘露醇利用最差,在测试氮源中,对谷氨酸利用最佳,对尿素利用最差；菌丝的最低致死温度为55℃、10min。另外,采用台盼蓝染色法研究了大蒜白斑病菌的侵染特性,结果表明,接种2 h后孢子即可萌发;6h后可形成多根芽管(多至11根)；接种8h后芽管在气孔附近分支形成侵染菌丝,从气孔侵入到寄主细胞中；12h后侵染菌丝不断分化可从多个气孔侵入；24 h后病菌在气孔中形成大量菌丝,侵入率显著增加。
　　 3.研究了大蒜自斑病菌毒素的基本性质及专化性。试验结果表明,PSB液体培养基是大蒜白斑病菌产毒的最佳培养基；毒素滤液经甲醇或丙酮处理后,小分子物质保留了毒素的致病活性；经蛋白酶或高温处理,毒素致病活性基本不变:乙酸乙酯和正丁醇对毒素的萃取能力最强,而氯仿和苯的萃取能力相对较弱；pH值对毒素滤液的致病活性有显著影响,且随pH值升高,其致病活性逐渐降低。另外,通过测定不同大蒜品种和寄主植物对S.solani的感病性及其对毒素的敏感性,可确定大蒜白斑病菌毒素为一种非寄主专化性毒素。
　　 4.采用薄层层析(TLC)和高效液相色谱(HPLC)法对大蒜白斑病菌毒素进行分离纯化,并结合化学鉴定、紫外可见吸收光谱(UV-VIS)、红外光谱(IR)、质谱(MS)、元素分析以及核磁共振(NMR)等分析方法鉴定毒素结构。结果表明,对24种TLC展开系统进行筛选,得到其最佳展开剂为乙酸乙酯:石油醚:甲醇=4:1:0.35,可分离得到13个组分,其中组分4为主要致病组分；组分4经HPLC纯化制备,共可收集到100 mg棕红色毒素纯品,将其命名为SS-toxin。在SS-toxin的结构鉴定中,通过化学反应可初步判断该毒素是一种酚类物质,而不是酯、生物碱、多肽、蛋白质或氨基类化合物；毒素在215 nm、264nm和458 nm处有紫外可见吸收峰；在红外光谱中可看出,毒素结构中有酚-OH(3400 cm-1)、-CH3(2946 cm-1、1449 cm-1、1395 cm-1)、芳香环(3092 cm-1、1595 cm-1)、-CO(1670 cm-1)和酮-C=O(1640 cm-1)存在的伸缩振动；根据ESI-MS和元素分析结果得到SS-toxin的分子式为C16H1608(分子量336)；进一步结合毒素的1H-NMR谱,将SS-toxin初步鉴定为7-甲氧基-2-甲基-1,2,3,4-四氢-1,2,3,4,5-五羟基葸醌(7-methoxy-2-methyl-1,2,3,4-tetrahydro-1,2,3,4,5-pentahydroxy anthraquinone)。
　　 5.为明确大蒜白斑病菌毒素的致病机理,研究了毒素组分SS-toxin对寄主植物生理活性、大蒜叶片细胞超微结构及叶片质膜系统的影响。结果表明,SS-mxin对抗、感品种的浓度.剂量曲线分别为Y=0.0546X+0.2966(R2=0.9694,P<0.05)和Y=0.0871X+3.3893(R2=0.9774,P<0.05):毒素对大蒜根、芽生长及根尖有丝分裂均有抑制作用,其中对根、芽的抑制中浓度分别为64.9和178.5μgml-1；大蒜叶片经毒素处理3d后,其叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量均有所下降,说明毒素与病害的症状发展有密切联系；电镜观察结果表明,用毒素处理感病品种叶片2 h后,细胞质膜内陷,细胞壁有轻微变形,6h后,线粒体脊数量减少,且出现空泡化,12 h后,叶绿体膜肿大,片层结构出现解体,核膜部分消失,24 h后,细胞壁明显断裂,而其它结构无明显变化:用毒素处理抗病品种叶片,12 h后,质膜开始出现内陷,细胞壁肿胀变形,24 h后,少数线粒体空泡化,其他细胞结构无明显变化,推测质膜为SS-toxin的早期作用位点。采用两相法制备大蒜抗、感品种叶片的质膜微囊,并通过特异性酶抑制剂测得抗感品种质膜的相对纯度均在70％以上。抗、感品种质膜经不同浓度毒素处理后,其H+-ATPase水解活力变化较为明显,随处理浓度升高,酶活性逐渐降低；用最高浓度200 gml-1毒素处理后,抗、感品种质膜H+-ATPase的相对活性分别降低至56.4％和41.4％:另外,抗、感品种质膜NADH氧化速率和Fe(CN)63-还原速率也均受抑制,以Fe(CN)63-作为电子受体时,抗、感品种质膜NADH相对氧化速率分别降低至45.8％和43.1％；以NADH作为电子供体时,抗、感品种质膜Fe(CN)63-相对还原速率分别下降至45.4％和18.9％。H+-ATP酶和标准氧化还原系统可能为SS-toxin在大蒜叶片细胞质膜上的作用位点。
　　 6.2006～2008年对大蒜白斑病的流行规律和防治技术进行研究,结果表明,2006-2007年病害于11月5日开始发生,至收获期病指达60.6,其中11月、12月和次年3月为发病高峰期,病指增长率分别为37％、14％和13％,而2007-2008年病害的发生推迟至11月24日,至收获期病指仅为27.5。大蒜白斑病菌越夏研究结果表明,病残体在温室(25℃,30％RH)、冰箱(4℃,90％RH)、土表、土表下10 cm和土表下20 cm条件处理165 d后,菌丝体均能存活,存活率分别为40.0％、2.9％、25.7％、17.1％和5.7％,统计病残体中分生孢子萌发率发现,处理165 d后仅温室和冰箱处理可观察到分生孢子萌发,萌发率分别为10.8％和5.7％。2006-2007年品比试验中,青秆软叶和软软叶抗病性最强,其RAUDPC分别为10.0和10.4,而红七星和温二早最为感病,RAUDPC分别为67.3和64.4。2007-2008年供试品种中,自选-2、青秆软叶和软软叶最为抗病,RAUDPC分别为2.7、3.4和3.9,而泰糯-1和山东济南最感病,RAUDPC分别为33.0和32.8。2006-2007年种子处理苗期防病试验中,种子处理剂2.5％适乐时悬浮种衣剂(0.05 g a.i.kg-1)和50％福美双可湿性粉剂(1.25 g a.i.kg-1)拌种防效最好,其RAUDPC值分别为23.0和23.7;且2007-2008年调查仍以适乐时和福美双的防效最好,其RAUDPC值分别为5.7和6.3。在PSA平板上测定9种杀菌剂对大蒜白斑病菌菌丝生长的抑制作用,以40％福星乳油的抑菌效果最好,EC50为0.4μgml-1；30％爱苗乳油、50％多菌灵可湿性粉剂、10％世高水分散粒剂和20.67％万兴乳油抑菌效果次之,其EC50分别为1.0μg ml-1、1.4μgml-1、2.0μgml-1和2.7μgml-1。2006-2007年田间药效试验中,40％福星乳油4000倍液和75％代森锰锌可湿性粉剂1000倍液、2000倍液防效最好,其RAUDPC分别为11.5、13.0和14.6;2007-2008年,40％福星乳油4000倍液、75％代森锰锌可湿性粉剂1000倍液和20.67％万兴乳油1000倍液的防效最好,RAUDPC分别为4.4、4.7和5.2,与对照药剂甲基托布津存在显著差异(P<0.05)。

目录

文摘

英文文摘

略缩语表(Abbreviation)

第一章 文献综述

1 匍柄霉属(Stemphylium)真菌研究

1.1 匍柄霉种属分类

1.2 生物学特性

1.3 产生毒素种类

2 匍柄霉属(Stemphylium)真菌病害研究概况

2.1 病害种类

2.2 侵染和流行

2.3 药剂防治

3 植物病原真菌毒素研究进展

3.1 化学类别

3.2 植物病原真菌毒素的分离与纯化

3.3 植物病原真菌毒素的生物测定

3.4 植物病原真菌毒素的致病机理

4 本研究的目的意义

第二章 大蒜白斑病病原学研究

1 材料与方法

1.1 田间症状调查

1.2 病原菌的分离及纯化

1.3 致病性测定

1.4 病原菌形态学鉴定

1.5 rDNA-ITS序列分析及系统发育树的构建

1.6 不同寄主来源菌株的致病力比较

1.7 大蒜白斑病菌生物学特性研究

1.8 大蒜白斑病菌对大蒜叶片的侵染过程观察

1.9 数据分析

2 结果与分析

2.1 田间症状调查

2.2 病原菌分离率

2.3 致病性测定

2.4 病原菌的形态学鉴定

2.5 序列分析

2.6 不同寄主来源菌株的致病力比较

2.7 大蒜白斑病菌生物学特性

2.8 大蒜白斑病菌对大蒜叶片的侵染过程观察

3 讨论

第三章 大蒜白斑病菌毒素的基本性质及专化性研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 产毒培养基的筛选

2.2 不同类型病斑中毒素的提取

2.3 毒素滤液中水溶性大分子物质的活性测定

2.4 蛋白酶对毒素生物活性的影响

2.5 活性碳对毒素滤液中活性成分的吸附情况

2.6 不同有机溶剂对毒素的萃取效果

2.7 不同温度和pH值对毒素滤液生物活性的影响

2.8 不同大蒜品种对大蒜白斑病菌的感病性及其对毒素的敏感性测定

2.9 不同寄主植物对大蒜白斑病菌的感病性及其对毒素的敏感性测定

3 讨论

第四章 大蒜白斑病菌毒素的分离、纯化及结构鉴定

1 材料与方法

1.1 供试材料、试剂及仪器

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 TLC展开剂的筛选

2.2 毒素的TLC分离

2.3 毒素的HPLC色谱条件优化

2.4 毒素的HPLC纯化及纯度鉴定

2.5 毒素的结构鉴定

3 讨论

第五章 大蒜白斑病菌毒素的致病机理研究

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 毒素的浓度.剂量曲线

2.2 毒素对根、芽伸长及根尖细胞有丝分裂的影响

2.3 毒素对叶片叶绿素含量的影响

2.4 毒素对叶肉细胞超微结构的影响

2.5 毒素对叶肉细胞质膜H+-ATPase水解活力及标准氧化还原系统的影响

3 讨论

第六章 大蒜白斑病的防治技术研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 大蒜白斑病田间流行因素分析

2.2 大蒜白斑病菌的越夏存活

2.3 不同大蒜品种的抗病性差异及产量比较

2.4 种子处理对大蒜白斑病的防治效果

2.5 不同杀菌剂对大蒜白斑病的防治效果

3 讨论

第七章 结论、创新点与展望

1 结论

2 创新点

3 展望

参考文献

附录 攻读博士学位期间发表论文

致谢