黑大豆种皮花色苷物质组成及其抗氧化活性与抗血管平滑肌细胞增生作用

摘要

随着基础医学研究的不断深入，人们逐渐认识到氧化应激是促进动脉粥样硬化等慢性疾病的发生发展的重要因素。探寻和研究具有抗氧化活性的天然植物化合物用于这些疾病的防治，成为医药、植物化学等多个学术领域共同关注的课题。黑大豆是我国传统的药食兼用的作物资源，其种皮含有大量多酚类化合物，是开发天然抗氧化剂的重要来源。本文通过比较60个黑大豆种质抗氧化活性和总酚、原花青素和花色苷含量差异，筛选出抗氧化活性最强、酚类物质含量最高的种质，并对其抗氧化活性与酚类物质进行相关性分析，从中确定黑大豆种皮中对抗氧化活性起主要作用的物质，再通过HPLC对主要活性物质进行定性定量分析，最后在细胞水平评价其抗氧化活性，并从抑制ox-LDL诱导VAMC增殖的角度探讨黑大豆种皮抗动脉粥样硬化的机理。主要研究结果如下：
　　 (1)分析了60个黑大豆种皮的总抗氧化能力(TAC)、氧自由基清除能力(ORAC)、DPPH·清除能力及其与总酚、原花青素和花色苷含量的差异和相关性。结果表明60份黑大豆种皮的TAC、ORAC、DPPH、总酚、原花青素和花色苷含量变幅和变异系数较大，表现出显著的基因型差异。云南地区的黑豆17501和大黑秧是抗氧化能力和酚类物质含量最高的黑大豆种质。相关性分析结果表明，原花青素和花色苷是黑大豆种质种皮抗氧化活性的主要物质基础。采用快速聚类法可以把60份黑大豆种质聚成4类，Ⅰ类为高脂肪黑大豆种质，Ⅱ类为高蛋白高花色苷黑大豆种质，Ⅲ类为高脂肪高活性黑大豆种质，Ⅳ类为低脂肪低蛋白低活性黑大豆种质。
　　 (2)参照Baj等人文献报道的色谱条件并对其进行优化，建立了一种准确高效的黑大豆种皮花色苷检测方法，并用该方法对60个黑大豆种质种皮花色苷的组成及含量进行了测定。黑大豆花色苷HPLC分析优化的色谱条件为：色谱柱XBridgeC185.0μm4.6mm×250mm，预柱4.6mm×20mm,检测波长520nm，进样体积20μL，柱温25℃，流动相：A：10％甲酸的水溶液B：25％乙腈，25％甲醇，10％甲酸，40％水：梯度洗脱：0～8min,16％～20％B；8～11min,20％～38％B；11～20min,38％～46％B。结果从60个黑大豆种质种皮中检测到飞燕草素-3-葡萄糖苷(Dp-3-glu)，矢车菊素-3-芸香糖苷(Cy-3-gal)，矢车菊素-3-葡萄糖苷(Cy-3-glu)，牵牛花素-3-葡萄糖苷(Pt-3-glu)，芍药定-3-葡萄糖苷（Pn-3-glu），锦葵素-3-葡萄糖苷(Mv-3-glu)共6种花色苷。其中有44个品种中检测到上述全部6种花色苷，而其余16个品种只含有其中的4-5种。其中Cy-3-glu在各品种中均为含量最高的花色苷组分，含量变幅为61.82-1617.44mg/100g，占总含量的48.81％-94.13％，大黑秧是总花色苷和Cy-3-glu含量最高的黑大豆种质(2129.6mg/100g和1617.6mg/100g)。
　　 (3)通过化学实验和细胞实验对花色苷单体的抗氧化活性进行追踪研究，并考察了其对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的抑制作用。结果表明Dp-3-glu、Cy-3-glu、Pt-3-glu、Mv-3-glu和Pn-3-glu5种花色苷单体清除DPPH·自由基能力表现为：Dp-3-glu＞Cy-3-glu＞Pt-3-glu＞Mv-3-glu＞Pn-3-glu。与天然抗氧化剂Vc比较，Dp-3-glu和Cy-3-glu清除DPPH·能力远大于Vc。Vc清除DPPH·的EC50值为7.62μg/mL，分别是Dp-3-glu，Cy-3-glu清除DPPH·EC50值的3.13、2.06倍。这5种花色苷单体均可不同程度的拮抗ox-LDL诱导VSMC增殖，Cy-3-glu抑制效果最高，且呈显著量效关系（P＜0.05）。Cy-3-glu可明显提高细胞超氧化物歧化酶(SOD)活力，抑制生物体的脂质过氧化反应，减少终产物丙二醛(MDA)的生成，同时还可抑制一氧化氮(NO)产生，且呈显著的量效关系(P＜0.05)。Cy-3-glu和Pn-3-glu可以抑制细胞由G0/G1期进入DNA合成的S期而抑制VSMC增殖，Cy-3-glu作用效果更明显。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表

第一章 绪论

1 氧化应激与动脉粥样硬化的关系

1.1 氧化应激的概念

1.2 氧化应激相关疾病及其防治

1.3 氧化应激促进动脉粥样硬化(AS)发生的机制

2 天然抗氧化剂花色苷类化合物的研究

2.1 花色苷类物质的结构、种类及性质

2.2 花色苷分析方法

2.3 花色苷类物质的抗氧化作用

3 天然抗氧化资源黑大豆的研究进展

3.1 黑大豆种质资源

3.2 黑大豆的功能特性及其相关研究

4 研究目的及意义

5 主要研究内容

第二章 不同黑大豆品种的抗氧化活性及其总酚、花色苷和原花青素含量的关系

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 试剂

1.3 仪器设备

1.4 方法

2 结果与分析

2.1 黑大豆种质的抗氧化活性及其总酚、原花青素和花色苷含量

2.2 不同生态区黑大豆种质抗氧化能力与总酚、原花青素和花色苷含量之间的关系

2.3 黑大豆抗氧化作用与其酚类化合物含量的相关性分析

2.4 黑大豆种质抗氧化作用及其酚类化合物、粗蛋白和粗脂肪含量的聚类分析

3 讨论

3.1 黑大豆品种间抗氧化活性差异

3.2 不同生态区黑大豆品种间抗氧化活性和酚类物质的差异

3.3 60个黑大豆种质的聚类分析

第三章 不同黑大豆种质种皮花色苷的组成分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 仪器设备及试剂

1.3 试验方法

1.4 统计分析

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

2.2 方法性能指标

2.3 花色苷组分的定性分析

2.4 不同黑大豆种质种皮花色苷构成

2.5 不同生态区黑大豆花色苷单体含量比较

2.6 不同黑大豆种质种皮抗氧化活性与各花色苷单体含量的相关性分析

3 讨论

3.1 不同黑大豆种质资源种皮花色苷组成及含量分析

3.2 黑大豆种质种皮花色苷构成比影响因素

3.3 黑大豆种质的抗氧化活性与花色苷含量的关系

第四章 黑大豆花色苷单体对ox-LDL诱导VSMC增殖的影响

1 材料与方法

1.1 主要仪器

1.2 主要试剂及其配制

1.3 大鼠原代主动脉VSMC分离及培养

1.4 VSMC冻存与复苏

1.5 五种花色苷单体体外清除DPPH．自由基能力研究

1.6 细胞培养实验

1.7 统计分析

2 结果与分析

2.1 5种花色苷单体清除DPPH·自由基能力

2.2 细胞毒性实验

2.3 不同花色苷单体对ox-LDL诱导增殖的抑制作用

2.4 Cy-3-glu对细胞MDA、NO含量和SOD活力的影响

2.5 Cy-3-glu分别与Pt-3-glu、Pn-3-glu组合对ox-LDL诱导增殖的影响

2.6 Cy-3-glu和Pn-3-glu对ox-LDL诱导VSMC周期的影响

3 讨论

3.1 结构差异对花色苷抗氧化活性的影响

3.2 增殖VSMC内的信号传递系统

第五章 结论与创新点

1 结论

1.1 不同黑大豆品种的抗氧化活性及其总酚、花色苷和原花青素含量的关系

1.2 不同黑大豆种质种皮花色苷的组成分析

1.3 不同黑大豆花色苷单体对ox-LDL诱导VSMC增殖的影响

2 创新点

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的相关学术论文