小麦胚乳细胞程序性死亡机理初探以及淹水胁迫对其进程的影响

摘要

前期研究已经证实小麦胚乳细胞的发育是一种特殊的细胞编程性死亡(programmed cell death, PCD)过程。环境胁迫对胚乳PCD发生具有重要的影响。其中，湿害作为一种自然灾害，严重影响小麦的产量和品质。目前，关于小麦胚乳细胞PCD机理及淹水胁迫对小麦胚乳淀粉质体和胚乳PCD进程的研究比较少。本研究以小麦品种(Triticum aestivumL.)华麦8号为实验材料，对处于开花期的小麦进行不同时间梯度的淹水处理，采用四个处理：不淹水处理(对照)、淹水3d(3dayswaterlogging treatment, 3DWT,)、淹水7d(7DWT)、淹水12d(12DWT)，然后恢复正常生长。从超微结构、TUNEL检测、DNA凝胶电泳和基因表达四个方面来探讨在发育后期的正常生长条件下，小麦胚乳细胞发生PCD的机理。同时，采用扫描电子显微术(Scanning Electron Microscope, SEM)和LUGOL染色对淹水条件下淀粉粒的发育状况进行观察；用透射电子显微术(Transmission Electron Microscope,TEM)、Evans-Blue染色法、TUNEL和DNA凝胶电泳检测来研究淹水胁迫对胚乳细胞PCD进程的影响。主要结果如下：
　　 1.正常生长条件下，胚乳细胞的超微结构显示花后12d(12dayspostanthesis,12DPA)，细胞核的双层核膜出现模糊，随后染色质开始凝集，但不发生典型的趋边化；细胞核降解形成核残体。25DPA，细胞核大量降解，在胚乳细胞中很难找到完整的细胞核。16DPA，线粒体发生降解，内质网发生膨胀、环化。说明，细胞核DNA在25DPA已大量降解。
　　 2.TUNEL检测表明12DPA，即可在原位检测到核DNA断裂，随后阳性核数目增加。16DPA，阳性核数目达到最大值。
　　 3.正常生长条件下，胚乳细胞的琼脂糖凝胶电泳检测显示，16DPA,DNA开始降解；30DPA，检测到典型的DNAladdering条带。
　　 4.RT-PCR结果表明，AGPase(葡萄糖焦磷酸化酶)的RNA相对表达量变化显著，3DPA,AGPase表达量较低；9DPA，其表达量增加；12DPA，表达量达到最大值；随后开始下降，21DPA,AGPase仅有少量表达。
　　 以上结果说明，胚乳细胞发生PCD，在细胞核大量降解之前，与淀粉合成相关酶基因的RNA已大量合成，从而为后期淀粉的合成提供了物质保证。
　　 5.花后小麦旗叶叶绿素含量呈下降趋势；淹水处理后，叶绿素含量下降趋势更加显著，且淹水时间越长，叶绿素含量越低。淹水造成籽粒体积减小，随着淹水时间的延长，现象越明显。
　　 6.胚乳细胞发育期间，淀粉粒数目增长呈S型变化。在发育早期(8～10DPA),不同处理胚乳细胞中淀粉粒数目均在20个左右。发育后期(20DPA)淀粉粒的数目差异明显，7DWT,12DWT的淀粉粒数目分别占对照的82.5％和68％。说明淹水造成胚乳细胞中淀粉粒数目减少。
　　 7.通过LUGOL染色和扫描电镜观察可知，短期淹水(3DWT)未造成淀粉粒数目减少；但长时间淹水(7DWT,12DWT)导致胚乳细胞变形严重，B型淀粉粒数目大量减少，胚乳充实度差。
　　 8.Evans-Blue染色证实，淹水加速了胚乳细胞的死亡，10DWT,10DPA，在胚乳背部即有少量蓝色出现。TUNEL实验发现淹水加剧胚乳细胞核DNA降解，开始降解时间提前，且随着淹水时间延长，阳性核比率升高。不淹水处理的小麦淀粉胚乳在30DPA出现典型的DNAladdering条带；而长时间淹水处理(12DWT)在20DPA就已经出现DNAladdering条带，说明淹水导致小麦胚乳细胞核DNA大量降解。TEM观察发现，不淹水处理的胚乳细胞核核膜在12DPA出现降解，而3DWT的胚乳在10DPA出现核膜降解；7DWT的胚乳细胞在8DPA核膜就开始降解。不淹水处理的胚乳细胞在12DPA，线粒体内嵴和内质网开始膨胀；而7DWT的胚乳在10DPA,线粒体就开始降解、内质网结构发生变形，形成潴泡。可见淹水造成细胞核、线粒体和内质网降解的时间提前。
　　 上述结果表明，淹水胁迫造成籽粒充实度下降、淀粉粒数目减少；小麦胚乳细胞的发育过程呈现一系列的PCD特征，如核膜降解、染色质凝集、线粒体和内质网的变形、降解，而淹水胁迫使胚乳细胞的PCD特征提前出现，且特征更加明显。

目录

文摘

英文文摘

缩略表

1 前言

1.1 胚乳细胞及淀粉质体的结构研究

1.2 细胞程序性死亡特征及其检测方法

1.2.1 细胞程序性死亡的一般特征

1.2.2 胚乳细胞的PCD

1.2.3 PCD检测方法

1.3 与植物PCD相关的信号

1.4 禾谷类作物胚乳PCD相关基因研究进展

1.5 淀粉合成过程中的相关酶类

1.6 水分胁迫对植物发育的影响

1.6.1 水分胁迫对植物生理的影响

1.6.2 水分逆境对植物组织超微结构的影响

1.7 植物激素和环境胁迫对籽粒灌浆和胚乳细胞PCD进程的影响

1.8 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2.1 材料的种植及取样

2.2 方法

2.2.1 旗叶叶绿素含量的测定

2.2.2 颖果发育的外部形态观察

2.2.3 显微和超微结构观察

2.2.4 DNA抽提和电泳

2.2.5 总RNA的提取及RT-PCR

2.2.6 胚乳淀粉质体发育的结构观察

2.2.7 胚乳细胞PCD进程检测

3 结果与分析

3.1 胚乳细胞PCD发生的机理

3.1.1 胚乳细胞的超微结构观察

3.1.2 TUNEL检测

3.1.3 DNA laddering检测

3.1.4 胚乳细胞中总RNA的提取及AGPase的RT-PCR检测

3.2 淹水胁迫对小麦淀粉质体和胚乳PCD进程的影响

3.2.1 淹水条件下小麦旗叶的叶绿素含量的测定

3.2.2 淹水对小麦颖果发育的外部形态影响

3.2.3 淹水处理对胚乳淀粉质体发育的影响

3.4 淹水对胚乳细胞PCD进程的影响

3.4.1 Evans-Blue染色

3.4.2 TUNEL原位检测DNA的断裂

3.4.3 DNA laddering检测

3.4.4 胚乳细胞PCD的超微结构特征

4 讨论

4.1 胚乳细胞PCD与淀粉合成酶相关基因的表达

4.2 胚乳细胞PCD发生的机理

4.3 胚乳PCD时间延长的原因和在农业生产上的意义

4.4 淹水与小麦籽粒重量的关系

4.5 淹水加剧小麦胚乳细胞PCD的进程的原因

4.6 淹水对胚乳细胞中淀粉质体发育的影响

4.7 后续研究的可能方向

参考文献

附录1 论文图版

附录2 在读期间发表和拟发表的文章

致谢