Exploring Ssr Markers Based on the Bes and Est Sequences for the Linkage Map of Citrus

摘要

微卫星标记现已被广泛应用于植物生物学以及植物育种学等研究领域,但是目前在柑橘属植物中所开发的SSR标记数量还比较有限。本研究利用公共数据库中柑橘BAC文库末端序列(BES序列)和EST序列,开发了4856对新的柑橘SSR分子引物,并且通过聚丙烯酰胺凝胶电泳实验全面评价了这些SSR标记在柑橘及其近缘属植物种间的通用性、多态性,及其在柑橘群体遗传学研究中的应用潜力,利用这些标记,构建了红橘×枳壳的遗传连锁图谱,具体结果如下:
　　 1.利用公共数据库中的BES序列和EST序列,通过Primer3软件分别设计了1025和3831对SSR引物,成功设计的这些引物对分别占到了预测的SSR位点的85.06％和93.92％。同时我们也发现在柑橘基因组中富含AT基序。利用400对BES-SSR引物和439对EST-SSR引物在16个柑橘或其近缘种中进行PCR扩增,结果显示,333对BES-SSR引物(83.25％)和368对EST-SSR引物(83.83％)具有扩增产物。
　　 2.将含有SSR位点的EST序列和BES序列通过blast搜索,结果显示2613条EST序列(占总序列76.22％)和236条BES序列(27.03％)能够找到与其相匹配的已知蛋白序列。功能注释显示60.12％的EST序列以及16.38％的BES序列与公共数据库中功能蛋白同源。由于有些序列功能分类并不止一种分类方式,因此在每一功能分类中BES或者EST序列比例总数并不等于100％。GO分类结果显示,40.78％的EST-SSR序列和13.52％的BES-SSR序列参与分子功能,43.82％的EST-SSR序列和0.57％的BES-SSR序列分别参与细胞组分,47.17％的EST-SSR序列和11.00％的BES.SSR序列参与生物进程。
　　 3.利用16个不同的柑橘及其近缘属材料检测BES-SSR和EST-SSR引物通用性,结果显示,76.99％的BES-SSR和65.00％的EST-SSR测试引物具有通用性。在BES-SSR和EST-SSR引物中,六核苷酸重复序列基序的SSR引物通用性都是最高的。在所开发的柑橘EST-SSR引物中,具有多态性的引物的比例没有BES-SSR类高。同时我们也发现,利用3’末端EST序列开发的SSR引物要好于5’末端所开发的引物。在16个柑橘及其近缘属中,利用EST-SSR引物所扩增的片段,其序列相似度要高于利用BES-SSR所扩增的片段。EST-SSR引物扩增序列相似度为92％-100％,而BES-SSR所扩增序列相似度为52％-100％。
　　 4.为了评价我们所开发的两类SSR引物在构建群体遗传连锁图谱中的效力,利用16个不同基因型柑橘植株,推导得到169个假定组合,我们主要统计了杂合位点百分比,多态性杂合位点百分比以及图谱构建能力百分比。BES-SSR类标记的杂合位点百分比在每一柑橘基因型中都高于EST-SSR标记。在各品种间,红橘和甜橙两品种杂合比例最高,枳壳杂合比例最低,酸橙居中。我们所用的材料中,也包含种间杂种,例如葡萄柚,枸橼,柚,红橘,橘等,他们的多态性杂合位点比率都很高,适合于遗传图谱比较研究。通过比较假定组合中多态性位点比例,我们认为未来可以构建柠檬和柚,红橘和枳壳,柠檬和红橘,柚和柠檬杂交F1代群体,为今后遗传图谱比较奠定基础。
　　 5.利用BES-SSR类引物和EST-SSR引物分别对35个柑橘及其近缘属材料进行遗传多样性分析。结果显示,两类引物都可以在35份材料中检测到遗传变异,并且都具有高度多态性。BES-SSR引物产生的confusion probability值较EST-SSR.的低,而confusion probability值与discriminating capacity值呈现负相关,所以与EST-SSR相比,BES-SSR具有较高的鉴别力。每一对引物的limit of discriminatingpower均值与actual discrimination power值很相近。BES-SSR标记产生的effectivenumber of patterns per assay unit(P)值最高,达到27.48。由两类引物计算得到的total number of effective alleles值,Assay efficiency index,Effective multiples ratio,Marker index都很相近。两类分子标记在35份柑橘及其近缘属材料中产生的种系关系图与前人研究结果相吻合,并且两类标记产生的聚类图具有高度一致,只有个别材料在聚类图中有所不同。
　　 6.在柑橘中,利用SSR分子标记评价其群体遗传结构等相关研究比较少,本研究比较了BES-SSR和EST-SSR标记在三个群体中的群体遗传结构,结果显示,两类SSR标记产生的群体遗传参数在相同群体个体中极其相似。
　　 7.利用本实验室所构建的红橘×枳壳杂交群体(102单株),选用1291对SSR标记引物,其中包含了我们所开发的高效EST-SSR,BES-SSR以及已经发表的SSR标记,构建高密度柑橘遗传连锁图谱,最终有36.64％的SSR引物具有群体作图能力。在作图群体中共得到382分离位点,其中有66个位点表现出偏分离,最终选择313个位点构建杂交群体框架图。遗传连锁分析结果表明,在313个位点中,227个位点是连锁位点,剩余的86个为不连锁位点,连锁位点分布在15个连锁群中,红橘×枳的图谱总长24293.9 mM,平均每位点距离107.02mM。同时我们也将45个偏分离位点添加到图谱中,并且大部分位点坐落在第一连锁群中。
　　 本研究中利用公共数据库中柑橘EST序列和克里曼丁BES序列,开发和鉴定出大量新的SSR标记,并构建了迄今为止柑橘中密度最高的遗传连锁图谱。本研究不仅为今后柑橘育种及其他柑橘相关研究提供了宝贵的SSR标记资源,也为今后开展柑橘比较图谱研究奠定了坚实基础。

目录

文摘

英文文摘

Abbreviations

1 INTRODUCTION

1.1 Background

1.2 Expressed sequence tag (EST)

1.3 BAC end sequence (BES) or Genome Survey Sequences (GSS)

1.4 SSR (Simple sequence repeat)

1.5 Utilization of EST and BES in the development of SSR marker

1.6 Use of SSR marker in plant breeding

1.6.1 Germplasm characterization and Genetic diversity study

1.6.2 Population genetic study

1.6.3 Hybrid identification and ploidy determination

1.6.4 Genetic mapping and marker assisted selection

1.7 Objectives

2 REVIEWS

2.1 Development and characterization of SSR marker in crop plants

2.2 The Molecular marker research in Citrus

2.2.1 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) markers

2.2.2 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) markers

2.2.3 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) markers

2.2.4 ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) markers

2.2.5 SSR (Simple Sequences Repeat) markers

2.2.5 Retrotransposon base markers

2.2.6 Others markers

2.3 Utilization of SSR markers in the linkage map construction in plant

2.4 Progress in linkage map of fruit tree species

2.4.1 Apple (Malus × domestica)

2.4.2 Almond (Prunus dulcis L)

2.4.3 Peach (Prunus persica L)

2.4.4 Apricot (Prunus. armeniaca L)

2.4.5 Citrus (Citrus spp.)

3 MATERIALS AND METHODS

3.1 Plant Materials

3.2 DNA extraction

3.3 Retrieval and processing of BES and EST sequences

3.4 Mining of BES and EST sequences for microsatellite

3.5 Primer design

3.6 PCR amplification and PAGE analysis

3.7 Functional annotation

3.8 Sequencing of the SSR band

3.9 Data Collection and Analysis

4 RESULTS

4.1 Development and characterization of Citrus SSR marker

4.2 Functional annotations of Citrus EST and BES SSR markers

4.3 Transferability of Citrus SSR markers across the related genera

4.4 utility of Citrus SSR marker for genetic mapping

4.5 Utility of Citrus SSR marker in establishing genetic relationship

4.6 Utility of Citrus SSR as population genetic marker

4.7 Linkage map of Citrus reticulata and Poncirus trifoliata

5 DISCUSSIONS

5.1 Development and characterization of citrus SSR marker

5.2 Functional annotations of citrus SSR marIcers

5.3 Transferability of citrus SSR markers across the related genera

5.4 Utiuty of Citrus SSR marker for genetic mapping

5.5 Utility of Citrus SSR marker in establishing genetic relationship

5.6 Utility of Citrus SSR as population genetic marker

5.7 Linkage map of Citrus reticulata and Poncirus trifoliata

6.CONCLUSION

7 REFERENCES

Acknowledgements

Appendix-Ⅰ

List of genotypes used for phyiogenetic analysis

Appendix-Ⅱ

Appendix-Ⅲ

List of pubication during Ph D

附件