苏云金芽胞杆菌菌株CT-43中苏云金素合成基因簇中thuE基因的功能鉴定

摘要

苏云金素（Thuringiensin，简称Thu）是由某些苏云金芽胞杆菌产生的，具有杀虫活性的小分子核苷类似物。本实验室前期研究通过构建苏云金芽胞杆菌CT-43的总DNA的BAC文库，经过HPLC筛选得到苏云金素的合成基因簇，并对此基因簇进行序列分析。BLAST分析显示，基因thuE的序列和丝氨酸激酶具有较高相似性，推测基因 thuE与苏云金素合成途径中的磷酸化有关。在此基础上，对菌株 CT-43中的基因thuE进行同源双交换敲除，敲除得到的突变株CT-43-A3不产苏云金素。初步证明基因thuE和菌株CT-43中的苏云金素合成相关。本研究在此基础上，对突变株CT-43-A3中基因thuE的功能进行互补，对基因thuE的体外催化功能进行鉴定。
　　本研究对突变株CT-43-A3中敲除的thuE基因进行功能互补，利用载体pHT304将含有启动子的基因thuE转入突变株CT-43-A3中，得到重组菌株。对得到的重组菌株发酵上清液进行HPLC分析，HPLC结果显示，重组菌株可以恢复Thu的产生。证明基因thuE和Thu的合成相关。
　　本研究利用PCR技术扩增得到菌株CT-43中的基因thuE的完整ORF，扩增到的基因thuE定向克隆到大肠杆菌表达载体 pGEX-6p-1中。得到的重组载体转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3），IPTG诱导表达，诱导后的菌株利用可以纯化含有GST标签的试剂盒对重组蛋白进行纯化，得到基因thuE的表达产物蛋白ThuE。
　　利用 CIAP处理 Thu，高效液相色谱和质谱联用检测处理后的物质的分子量为620.1593。处理后的物质在一级质谱的基础上进行二级质谱分析，二级质谱解析分子量为620.1593的物质，并结合推测的苏云金素合成途径，证明CIAP处理Thu得到的分子量为620.1593的物质为不含磷酸基团的前体物。其特征与推测的蛋白ThuE的底物前体物C相同。将蛋白ThuE和前提物C在缓冲体系中进行体外催化处理，高效液相色谱和质谱对催化结果进行分析。结果显示体外催化后的体系中含有Thu。证明蛋白ThuE可以在体外催化体系中和前体物C反应生成Thu。
　　别粘酸是Thu的分子组成成分之一。本研究利用蛋白ThuE对别粘酸进行体外催化分析，对蛋白 ThuE的底物特异性进行检测。催化反应体系经过高效液相色谱检测显示，催化后物质的保留时间和别粘酸不同，质谱分析得到新的分子量，说明蛋白ThuE可以在体外催化别粘酸形成新的物质。
　　本研究证明，基因thuE和Thu的合成相关。其功能为，在Thu合成过程中行使磷酸激酶的功能，在前体物C上加上磷酸基团从而合成Thu。此功能符合推测得到的苏云金素合成途径中基因thuE的功能。本研究对基因thuE的功能分析验证了基因thuE在Thu合成途径中的功能，为Thu合成途径的进一步验证打下了良好的基础。

目录

声明

缩 略 语 表

1 前言

1.1 苏云金素简介

1.1.1 苏云金素的性质

1.1.2 苏云金素产生菌及其杀虫机理

1.1.3 苏云金素发酵和检测研究进展

1.1.4 苏云金素合成基因簇研究进展

1.1.5 苏云金素的安全性评测

1.2 蛋白激酶研究进展

1.3 本课题的研究意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株、质粒

2.1.2 培养基

2.1.3 试剂和仪器

2.2 实验方法

2.2.1 DNA常规操作

2.2.2 SDS-PAGE

2.2.3 Tricine-SDS-PAGE

2.2.3 苏云金素的分离纯化和检测

2.2.4 基因thuE的表达、纯化与活性检测

2.2.5 苏云金芽胞杆菌膜蛋白的提取和检测

3 结果与分析

3.1 突变株CT-43-A3中基因thuE的功能互补

3.1.1 CT-43和突变株CT-43-A3表型检测

3.1.2 互补载体的构建

3.1.3 重组菌株的筛选和检测

3.2 基因thuE在大肠杆菌BL21中的表达和纯化

3.2.1 表达载体的构建

3.2.2 thuE基因的诱导表达

3.3 ThuE体外催化功能

3.3.1 ThuE前体物的确定

3.3.2 蛋白ThuE体外催化功能的确定

3.3.3 ThuE体外催化底物特异性的研究

3.4 CT-43与CT-43-A3膜蛋白的提取

4 讨论

5 总结

参考文献

致谢

附录1

附录2