日本血吸虫病环介导等温扩增诊断方法的建立和初步应用

摘要

血吸虫病是由寄生在人体和牛羊猪等哺乳动物体内的血吸虫引起的一种以肝脏肿大、消瘦、贫血、脾脏肿大、营养性水肿和腹水为主要症状的寄生虫病。我国目前血吸虫患者有800,000之多，受威胁人数达到2亿，给人民生活和生产造成了很大危害，若不及时治疗，可导致死亡。
　　 传统诊断血吸虫抗原的方法包括：沉淀集卵镜检法和毛蚴孵化法。这两种方法虽然费用低，简单易行，但因耗费时间长，对镜检人员的技术要求高，工作量大、漏检率高等缺点而难以满足人们查病治病的需求。
　　 血吸虫病的免疫学诊断方法也有多种，如间接血凝实验、酶联免疫法、免疫磁珠法和胶体染料试纸条法等。这些方法虽然简便易行可以做大规模的流行病学研究，但由于针对抗原的血清抗体在宿主体内长期存在，不能区别早期感染和既往感染，不能考核治疗效果。
　　 血吸虫的分子生物学诊断方法主要包括传统的聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)，实时荧光定量PCR方法(Real-TimePCR)等，由于这些方法都需要昂贵的仪器设备和复杂的检测方法，所以限制了其临床应用。
　　 环介导等温扩增（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）是由日本学者Notomi于2000年发明的一种新型体外恒温核酸扩增方法，主要是利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，在等温条件进行高效扩增反应。基因的扩增和产物的检测可一步完成，目前，该技术已被应用于病毒，细菌，动物原虫等疾病的检测。
　　 本研究通过选取日本血吸虫基因组中高度保守的多拷贝重复序列rbp(RNA binding protein)基因为靶序列进行LAMP引物设计。建立了粪便中血吸虫卵的LAMP检测方法和PCR检测方法。
　　 敏感性实验表明，这种方法较传统的PCR方法具有更高的敏感性。LAMP方法对血吸虫卵的检测极限是1.25个虫卵/克粪便。同时对牛常见的病原体如：东方巴贝斯虫，泰勒虫等进行LAMP扩增反应，未发现非特异性扩增反应。说明其具有较好的特异性。
　　 通过家兔感染血吸虫后，收集粪便和提取基因组，用毛蚴孵化法，PCR和LAMP方法研究了血吸虫及其虫卵在家兔体内的动态变化规律，发现LAMP方法能在家兔感染35天后在粪便中扩增到血吸虫虫卵DNA，而毛蚴孵化法和PCR方法在感染后38天和41天后检出，说明LAMP方法能更早检测出粪便中虫卵。同时利用本实验室建立的血吸虫Sj23-LHDIgG间接ELISA检测方法，对感染家兔每周采集的血清进行检测后发现：血吸虫抗体在感染3周后开始转阳，而且可以一直维持到感染后20周才逐渐转阴。
　　 最后，通过运用粪孵法和LAMP以及PCR方法，对采自湖北和湖南省血吸虫疫区的82份样品检测。结果LAMP方法检测出9份，传统的PCR方法和粪孵法分别检出3份和2份，表明LAMP方法具有较高的敏感性。
　　 鉴于LAMP方法的简便性和经济实用性，有望开发成为一种新的日本血吸虫的检测试剂盒。

目录

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缩略词表

第一章 综述

1.1 日本血吸虫病

1.2 日本血吸虫病的危害和流行病学特点

1.3 日本血吸虫病原特性及其生活史

1.4 日本血吸虫的致病机理及生物学特性

1.5 日本血吸虫分子生物学研究进展

1.6 日本血吸虫的免疫学反应

1.7 日本血吸虫病的临床检测和实验室检查

1.8 日本血吸虫病的防治

1.9 日本血吸虫疫苗研究进展

1.10 环介导等温扩增技术简介

第二章 研究的目的和意义

第三章 材料与方法

3.1 材料与方法

3.2 试验方法

第四章 结果与分析

4.1 LAMP扩增体系的建立

4.2 LAMP方法的特异性

4.3 LAMP方法的敏感性

4.4 LAMP产物的检测及验证

4.5 血吸虫PCR检测方法的建立

4.6 家兔感染血吸虫后血清中IgG抗体的检测

4.7 三种检测日本血吸虫方法的比较

4.8 LAMP方法的临床应用

第五章 讨论与结论

5.1 讨论

5.2 结论

参考文献

致谢