dsRNA介导的番木瓜环斑病毒(PRSV)的抗病性研究

摘要

番木瓜环斑病毒病是番木瓜的第一大病毒性病害，到目前为止，还没有完全根治该病的方法，只能采取以栽培措施为主的综合防治措施。植物基因工程的发展为植物抗病毒的研究提供了一条新的途径，尤其是随着RNAi领域研究的快速发展，利用反向重复表达载体对植物进行遗传转化成为研究植物抗病毒研究的一大热点。将来源于病毒本身的基因导入病毒的植物寄主，均能够使植物获得一定的抗病性。
　　 本研究以烟草、番木瓜和拟南芥作为实验材料，利用农杆菌介导法将外壳蛋白CP基因反向重复表达载体pHellsgate12-CPIR导入到受体材料中，并分析了转基因的抗病性，主要研究结果如下：
　　 RT-PCR检测结果显示，在接种PRSV后，野生型烟草中有高浓度的病毒CPmRNA的积累，而转pHG12-CPIR基因烟草中几乎没有病毒CP mRNA的积累，说明转pHG12-CPIR基因烟草中已启动RNAi机制抑制了CP基因的表达。
　　 (2)选取番木瓜苗进行农杆菌瞬时表达实验，对子叶注射含有pHG12-CPIR载体的农杆菌，并设置对照。4d后子叶接种PRSV。在接种病毒7d后对顶生新叶进行症状观察发现，不接种农杆菌或接种农杆菌GV3101后，顶生新叶产生明显的枯斑且叶片有邹缩、褪绿的现象，而接种农杆菌pHG12-CPIR-GV3101后无明显表型变化。说明后者对PRSV已产生抗性。
　　 RT-PCR检测结果显示，在接种PRSV后，不接种农杆菌或接种农杆菌GV3101的番木瓜内有高浓度的病毒CP mRNA的积累，而接种农杆菌pHG12-CPIR-GV3101的番木瓜内几乎没有病毒CP mRNA的积累，说明接种农杆菌pHG12-CPIR-GV3101的番木瓜内己启动RNAi机制抑制了CP mRNA的表达。
　　 (3)采用花浸法对拟南芥进行pHG12-CPIR载体的遗传转化，对T1代种子进行抗性筛选获得3株阳性苗。提取基因组DNA后用CP基因和NPTⅡ基因特异引物进行PCR检测均有目的扩增条带。3株阳性苗分别用pHG12-1、pHG12-2和pHG12-3表示。而后对这3株阳性苗分单株收取T2代种子。抗性筛选后进行阳性率统计发现，pHG12-1和pHG12-3 T2代种子筛选的阳性率均接近75％,说明pHG12-1和pHG12-3 T1代阳性苗为杂合体。而pHG12-2 T2代种子筛选的阳性率接近于100％，说明pHG12-2 T1代阳性苗为纯合体。对pHG12-2T2代移栽阳性苗随机取6株提取基因组DNA后用CP基因和NPTⅡ基因特异引物进行PCR检测均有目的扩增条带。
　　 选取播种30d的pHG12-2T2代阳性苗和野生型拟南芥的轮状叶进行攻毒试验。7d后对非接种轮状叶进行表型观察发现，接种了PRSV的野生型拟南芥的非接种轮状叶有变黄的特征，而接种了PRSV的转基因拟南芥的非接种轮状叶无明显表型变化。
　　 RT-PCR检测结果显示，在接种PRSV后，野生型拟南芥中有高浓度的病毒CP mRNA的积累，而转pHG12-CPIR基因拟南芥中几乎没有病毒CP mRNA的积累，说明转pHG12-CPIR基因拟南芥中已启动RNAi机制抑制了CP基因的表达。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

1 前言

1.1 课题的提出

1.2 番木瓜环斑病毒(papaya ringspot virus， PRSV)研究进展

1.2.1 株系及寄主范围

1.2.2 典型症状和危害

1.2.3 番木瓜环斑病毒的分子生物学特征

1.3 外壳蛋白(CP)基因介导的抗病毒基因工程研究进展

1.3.1 外壳蛋白基因的作用机理

1.3.2 国内外研究的现状及存在的问题

1.3.3 番木瓜抗病毒基因工程研究进展

1.4 RNAi(RNA interference)技术介导的抗病毒基因工程

1.4.1 RNAi的机制

1.4.2 RNAi技术的特点

1.4.3 RNAi介导的抗病毒方法

1.5 研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌株、质粒与毒源

2.1.3 试剂与仪器

2.1.4 培养基

2.1.5 PCR使用的引物

2.2 实验方法

2.2.1 质粒转化大肠杆菌

2.2.2 大肠杆菌质粒DNA提取

2.2.3 农杆菌感受态细胞的制备

2.2.4 质粒转化农杆菌

2.2.5 烟草植株的扩繁与移栽

2.2.6 烟草接种番木瓜环斑病毒

2.2.7 植物总RNA的提取

2.2.8 RNA琼脂糖变性凝胶电泳

2.2.9 RT-PCR

2.2.10 番木瓜苗的种植

2.2.11 农杆菌渗入试验

2.2.12 番木瓜接种番木瓜环斑病毒

2.2.13 拟南芥遗传转化

2.2.14 拟南芥转化子的筛选

2.2.15 植物总DNA的提取

2.2.16 拟南芥T2代转化子阳性率计算

2.2.17 拟南芥接种番木瓜环斑病毒

3 结果与分析

3.1 pHG12-CPIR转基因烟草的抗病毒分析

3.1.1 番木瓜环斑病毒接种烟草

3.1.2 转基因烟草的抗病分子检测

3.2 农杆菌介导的番木瓜瞬时表达体系的抗病毒分析

3.2.1 番木瓜环斑病毒接种番木瓜

3.2.2 RNA提取与RT-PCR检测

3.3 pHG12-CPIR转化拟南芥与抗病毒分析

3.3.1 pHG12-CPIR转化拟南芥

3.3.2 pHG12-CPIR转基因拟南芥的抗病毒分析

4 讨论

4.1 转基因植株的抗病性检测

4.2 农杆菌介导的基因瞬时表达体系的研究

4.3 拟南芥遗传转化与检测

4.4 下一步工作及展望

参考文献

致谢

附录一 图版与说明

附录二 相关药品的配制