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【6h】

新鲜莲子壳中黄酮的结构鉴定、抗氧化活性及抗肿瘤活性评价

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目录

文摘

英文文摘

Abbrevations

Chapter 1 Introduction

1.1 General information about the lotus plant

1.2 Motivation of this study

1.3 Introduction to flavonols and the health benefits of the lotus

1.4 Study aims and general design

1.5 Hypothesis and objectives

1.6 Organisation of the thesis

Chapter 2 Literature Review

2.1 General information about the lotus

2.2 Nutritional value of the lotus

2.3 Traditional knowledge of the lotus

2.4 Antioxidants of the lotus

2.5 Anticancer activity of the lotus

2.6 Inedible parts of the lotus

2.7 Phenolics

2.7.1 Properties and classification of phenolic compounds

2.7.2 Bioactivities of dietary polyphenols

2.7.3 Flavonoids

2.8 Several techniques

2.8.1 Extraction

2.8.2 Column chromatography

2.8.3 Preparative HPLC

2.8.4 Liquid chromatography (LC)-MS

2.9 Evaluation of antioxidant capacity

2.9.1 HAT assays using molecular probes

2.9.2 ET assays using molecular probes

2.10 In vitro anticancer screening

2.10.1 Proliferation assay

2.10.2 Cell cycle analysis

2.10.3 Western blot analysis

2.11 References

Chapter 3 Materials and Methods

3.1 Plant materials

3.2 Chemicals and instruments

3.3 Flavonols extraction from FSENN

3.4 Fractionation of EFESEL

3.5 Evaluation of antioxidant activities

3.5.1 Determination of total phenolic content

3.5.2 DPPH radical scavenging activity

3.5.3 Test for ferric ion reducing capacity

3.5.4 Determination of T-AOC

3.5.5 Determination of antioxidant activity by the B-carotene bleaching method

3.5.6 Chemiluminescence assay

3.6 Identification of flavonols and flavonol content

3.6.1 Acid hydrolysis of EFSENN Fr2

3.6.2 Preparation of flavonols standard solutions

3.6.3 Identification and quantify of flavonol by HPLC

3.6.4 LC/UV/MS analysis

3.7 In vitro anticancer screening

3.7.1 Cell cultures

3.7.2 MTT assay

3.7.3 Flow cytometric analysis

3.7.4 Western blot analysis

3.8 Statistical analyses

3.9 References

Chapter 4 Results and Discussion

4.1 Yield of the flavonoid extract from FSENN

4.2 Evaluation of antioxidant activities

4.2.1 Total phenolic content

4.2.2 DPPH radical scavenging activity

4.2.3 Test for ferric ion reducing capacity

4.2.4 Determination of T-AOC

4.2.5 Determination of antioxidant activity by the β-carotene bleaching method

4.2.6 Chemiluminescence assay

4.3 Identification and quantification of flavonols

4.4 LC/UV/MS analysis

4.5 In vitro anticancer screening

4.5.1 In vitro assay for cytotoxic activity (MTT assay)

4.5.2 Effect of flavonols in Fr2 on cell cycle distribution

4.5.3 Effect of Fr2 on p21 and p53 expression

4.5.4 Effect of flavonols in Fr2 on Bcl-2 and Bax

4.5.5 Effect of flavonols in Fr2 on NF-кB

4.6 Referances

Chapter 5 Conclusions and Recommendations

5.1 Conclusions

5.2 Recommendations

Appendix

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Testimony of editing and proofreading

Acknowledgements

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摘要

莲子中含有促进健康的营养成分,其提取物(EFSENN)具有抗氧化和清除自由基活性。然而,对新鲜莲子壳(FSENN)中黄酮类物质的抗氧化活性、抗肿瘤活性及其结构鉴定鲜见报道。本研究的主要目的是鉴定莲子壳60%甲醇提取物(EFSENN)中的抗氧化活性组分,并鉴定其中一个组分中的黄酮类物质,了解其结构和抗肿瘤活性。在这里,结合了现代分析技术、生物技术以及分子生物学来研究从EFSENN分离得到的黄酮类物质的结构和生物活性。主要结果如下:
   1.黄酮提取和FSENN中的组分
   用60%的甲醇溶液从2000g莲子壳中可以得到25g提取物(EFSENN),EFSENN用Toyopearl HW-40S进行分级,得到三个组分,分别为Fr1(130 mg),Fr2(1.8 g)和Fr3(200 mg)。采用Folin-Ciocalteu方法来测定组分中总酚的含量,Fr3中的总酚含量(相当于872.87mg没食子酸/g)比Fr2和Fr1高,其分别为768.11和138.75mg没食子酸/g。
   2.鉴定EFSENN中Fr2的黄酮苷元种类及其含量
   利用HPLC-UV来确定从EFSENN分离得到Fr2中的苷元组成:通过与已有的标准品比对,可以知道Fr2中含有四种苷元,分别为杨梅黄酮,槲皮素,山奈酚和异鼠李素;通过制作标准曲线来测定这四种苷元在Fr2中的含量,其中槲皮素(10.2mg/g干重)高于异鼠李素(6.2 mg/g干重),其次是山奈酚(2.8 mg/g of干重)和杨梅黄酮(0.4 me,/g干重)。
   3.LC/UV/MS分析
   利用LC/UV/MS在线分析Fr2中的黄酮的成分。在负离子模式下得到的有效信息,包括分子量、苷元以及糖基组成,进而分析得到六种糖基化组分。通过以下信息可以推断出峰1为杨梅黄酮-脱氧己糖:其准分子离子峰m/z[M-H]-为479,苷元离子峰m/z[A-H]-为316.9,A环碎裂为碎片离子m/z150.9和其他碎片离子270.9两部分。通过与芦丁标准品对照可以推出峰2是芦丁(609 m/z)。峰3是槲皮素.脱氧己糖,其准分子离子峰m/z[M-H]-为463,而其二级质谱峰为at m/z300.9。通过以下信息可以推断出峰4是山奈酚.单六碳糖.单六碳糖:其m/z[M-H]-为593,而二级质谱m/z[A-H]-为285。峰5为异鼠李素-单六碳糖-单六碳糖,其准分子离子峰m/z[M-H]-为623,而二级质谱[A-H]-315的进一步碎片离子为m/z270.9和m/z254.9。通过分子离子峰m/z[M.H]-为477,以及碎片离子m/z[A-H]-为315和A环裂解的两个碎片离子m/z150.8和m/z270.9,可以推断出峰6为异鼠李素.脱氧己糖;通过分子离子峰m/z[M-H]-301,以及其二级碎片离子m/z178.9、m/z150.8和m/z106.9可以推出峰7为槲皮素。
   4.EFSENN中组分的抗氧化活性
   通过DPPH自由基清除实验、β-胡萝卜素漂白方法分析、铁离子还原实验和总抗氧化能力的测定等体外抗氧化(T-AOC)实验来评价其抗氧化活性。采用CuSO4-Phen-Vc-H2O2-DNA化学发光法测定组分在抑制DNA氧化损伤的作用;在体外,通过化学发光方法测定组分清除羟基自由基(CuSO4-Phen-Vc-H2O2 system)和过氧化氢(luminol-H2O2 system)的能力;比较分析得出,Fr3清除DPPH自由基的能力最大,其在β-胡萝卜素漂白实验中显示出最强的抗氧化能力,然后依次是Fr2和Fr1;从我们的实验结果中可以得知,这几个组分都有显著的使铁离子还原成亚铁离子的能力;组分的总抗氧化能力从32.4到113.4U/mg,其中以Fr2的最强;其次是Fr3和Fr1;结果显示Fr3在抑制DNA损伤作用的能力比Fr2和Fr1高,其IC50分别为5±0.85,8.3±0.09和46.2±0.13μg/mL:Fr2清除羟基自由基的IC50(40±0.14μg/mL)是最小,依次是Fr3和Fr1;在清除过氧化氢实验中,Fr2和Fr3的能力相同(0.62μg/mL)。
   5.体外抗肿瘤活性研究
   Fr2的体外抗肿瘤活性是通过MTT法来测定组分对HeLa细胞的毒性作用,然后通过流式细胞仪和免疫印迹等来确定其抗肿瘤活性,MTT结果表明样品存在良好的剂量.效果关系,其IC50μg/mL,为50μg/mL,在样品浓度为200μg/mL时,能最大抑制细胞生长(>90%)。用浓度为150μg/mL的样品处理细胞,其G2/M分裂期递增15.96±0.59%。与对照组的G1浓度降低相比,用Fr2处理过的细胞其G2/M分裂期呈现递增趋势。这些结果表明Fr2中的黄酮类物质经由G2/M分裂期来抑制细胞增殖存在剂量-效应关系。进一步研究,得出对Bax具有上调节作用,Bc12具有下调节作用,以及对NF-κB的抑制作用。
   6.结论
   EFSENN中的各个组分都有很高的抗氧化活性,Fr2中的黄酮类物质具有抗肿瘤活性,将可以用于治疗和预防多种疾病,并具有作为保健食品的潜力。

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