TSA与5-aza-dc对早期牛孤雄胚体外发育的作用

摘要

DNA甲基转移酶抑制剂5-杂氮脱氧胞苷（5-aza-dc）与组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素 A（TSA）是两种表观修饰剂，在体细胞克隆中用于对供体细胞或胚胎进行重编程，参与 DNA的甲基化、组蛋白的乙酰化、染色质重塑等过程，使核移植胚的表观重编程更充分，提高体细胞克隆效率；低浓度的TSA处理孤雌胚能够促进胚胎的发育能力，但这两种抑制剂在牛孤雄胚中的作用尚未见报道。本研究利用TSA与5-aza-dc分别处理牛孤雄胚，观察这两种抑制剂对牛孤雄胚早期体外发育的作用；同时优化这两种抑制剂的处理条件（处理浓度、处理时间及处理阶段）；在此基础上，检测TSA处理后组蛋白H3的乙酰化水平及参与表观重编程的基因的相对表达量，进一步分析TSA对牛孤雄胚体外发育的作用机制，研究结果如下：
　　1. TSA对早期牛孤雄胚体外发育的作用
　　培养液中添加浓度为0（对照）、5、10、15、20和50nmol/L的TSA，在重构胚激活后培养孤雄胚15h，然后用未添加TSA的培养液继续培养，分析TSA对孤雄胚体外发育的作用及其与浓度的关系。结果发现，在培养液中添加TSA有利于孤雄胚的发育，最适浓度为5nmol/L，表现为卵裂率（80.6%）、16-细胞期胚胎率（46.8%）、桑椹胚率（29.0%）及囊胚率（12.9%）最高（P<0.05）。
　　用含TSA10 nmol/L的培养液在重构胚激活后培养孤雄胚0、10、15、20和25h，比较TSA作用时间对孤雄胚体外发育的影响。结果发现，培养15h和20h的胚胎卵裂率、16-细胞期胚胎率和囊胚率均显著高于对照组（P<0.05）。说明 TSA作用15h或20h对牛孤雄胚的早期体外发育效果最佳，而作用时间不足或过长均不利于牛孤雄胚的早期体外发育。
　　在TSA处理过程中设计三个处理时期，即休整期（激活前2h开始处理）、激活期（激活开始处理）与培养期（激活完成后开始处理），TSA的处理浓度均为10nmol/L，总的作用时间均为15h，对照组未添加TSA。结果显示，不同的处理阶段对卵裂率、16-细胞期胚胎率及桑椹胚率影响不明显（P>0.05）；在囊胚率方面，培养期处理组囊胚率达到9.7%，显著高于其它各组（9.7%vs.0.0%P<0.05）。说明TSA在培养期处理牛孤雄胚具有较好的效果。
　　2.5-aza-dc对早期牛孤雄胚体外发育的作用
　　培养液中添加浓度为0（对照）、0.1、1和10nmol/L的5-aza-dc，在重构胚激活后培养孤雄胚24h，比较5-aza-dc浓度对孤雄胚体外发育的影响。不同浓度（0.1、1、10nmol/L）的处理组间在卵裂率、16-细胞期胚胎率、桑椹胚率及囊胚率方面差异不显著（P>0.05），但均高于对照组；1 nmol/L处理组胚胎卵裂率显著高于对照组（78.8%vs.60.7% P<0.05），且囊胚率达到7.6%，高于其它各组，表明1nmol/L的5-aza-dc是最佳的处理浓度。
　　用含5-aza-dc1 nmol/L的培养液在重构胚激活后培养孤雄胚0、15、24和48h，比较5-aza-dc作用时间对孤雄胚体外发育的影响。结果发现，培养24h的胚胎卵裂率、桑椹胚率和囊胚率均显著高于对照组（P<0.05），但与其它处理组（15h和48h）间差异不显著（P>0.05）；在囊胚率方面24h处理组显著高于对照组与15h处理组（P<0.05）。
　　3. TSA对组蛋白乙酰化水平及表观修饰相关基因表达的影响
　　利用组蛋白 H3抗体检测组蛋白乙酰化水平，设计四个组，两个对照组（孤雄组与孤雌组）与两个TSA处理组（5nmol/L，20nmol/L），处理时间为胚胎培养期作用15 h，检测体外培养2-5d的胚胎。结果发现，不同浓度（0nmol/L，5nmol/L，20nmol/L）的TSA处理对组蛋白H3的乙酰化水平影响不明显，但均低于同一时期的孤雌胚胎的乙酰化水平；同一处理组（0nmol/L或5nmol/L或20nmol/L）不同发育阶段的胚胎，组蛋白 H3的乙酰化水平存在差异，表明孤雄胚的乙酰化水平低于孤雌胚，且随着胚胎发育的进行组蛋白的乙酰化水平逐渐增强。
　　牛孤雄重构胚激活后，用含0、5和20 nmol/L TSA的培养液培养15h，提取胚胎RNA，应用荧光定量PCR方法检测组蛋白去乙酰化酶基因（HDAC1，HDAC2）、乙酰基转移酶基因HAT1与DNA甲基转移酶基因（DNMT3a，DNMT3b，DNMT1）的表达量，发现用TSA处理后，上述所有去乙酰化酶基因和DNA甲基转移酶基因的表达量均下降，且抑制作用随 TSA浓度的增加而增强（P<0.05）。基因 HAT1在TSA处理后的表达量也低于对照组（P<0.05）。结果表明，TSA能够抑制牛孤雄胚组蛋白去乙酰化酶和DNA甲基转移酶基因的表达，但并不能促进HAT1基因的表达。

目录

声明

缩略词表(Abbreviations)

第一章 文献综述

1 组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A（TSA）

2 DNA甲基转移酶抑制剂5-杂氮脱氧胞苷（5-aza-dc）

3 哺乳动物孤雄生殖研究进展

第二章 TSA对早期牛孤雄胚体外发育的作用

1 前言

2 试验材料与方法

3 数据统计

4 结果与分析

5 讨论

6 结论

第三章 5-aza-dc对早期牛孤雄胚体外发育的作用

1 前言

2 试验材料与方法

3 数据统计

4 结果与分析

5 讨论

6 结论

第四章 TSA对组蛋白乙酰化水平及表观修饰相关基因表达的影响

1 前言

2 试验材料与方法

3 数据统计

4 结果与分析

5 讨论

6 结论

参考文献

附表

附图

致谢