柿子单宁体内外抗氧化活性及结构研究

摘要

本文以柿子为原料，选择了适于分离纯化柿子单宁的大孔树脂；比较了不同聚合度柿子单宁的体内外抗氧化活性；研究了柿子单宁（柿子单宁）对D-半乳糖(D-gal)诱导的氧化损伤的保护作用；探索了柿子单宁在体外体系中对低密度脂蛋白(LDL)氧化损伤的保护作用；对柿子单宁的结构特征进行了研究。研究结果如下：
　　 1.柿子单宁的大孔树脂的选择。
　　 为了选择对柿子单宁纯化性能较好的树脂，对五种大孔树脂进行了吸附与解吸实验。通过静态、动态吸附试验，比较了五种树脂对柿子单宁的吸附量、吸附率、解吸率、使用次数等指标。结果表明，B型树脂对柿子单宁具有吸附量大、易解吸、重复使用次数多、脱糖效果好等特点，是分离柿子单宁较理想的吸附树脂。
　　 2.不同聚合度柿子单宁级分及柿子单宁的体外抗氧化作用。
　　 主要采用还原能力、清除羟基自由基能力、清除DPPH·及ABTS+·自由基的能力，以及对小鼠体外脂质过氧化的抑制作用等方法对柿子单宁级分的抗氧化效果进行了综合评价。结果显示，三个级分及柿子单宁在体外的各体系中均有很好的抗氧化效果，对体外脂质过氧化有很好的抑制作用，且其抗氧化效果随着聚合度增加而增强。
　　 3.柿子单宁及级分Ⅲ对溴苯诱导的急性氧化损伤的保护作用。
　　 溴苯模型的动物实验结果表明，柿子单宁及聚合度高达33.6的级分Ⅲ在体内可以防止由溴苯引发的血清及肝匀浆超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的下降(P＜0.01)及丙二醛水平的上升(P＜0.01)。两者均有很好的抗氧化效果，其效果不逊于低聚体含量大于70％的葡萄籽原花青素。但总体而言，柿子单宁的抗氧化效果优于级分Ⅲ。
　　 4.柿子单宁对D-gal诱导的衰老小鼠的认知障碍及氧化损伤的保护作用。
　　 实验小鼠被分为六组，皮下注射D-gal或生理盐水六周，剂量为150mg/kg；从第三周开始同时灌胃不同剂量的柿子单宁。六周试验完成后，通过矿场试验及水迷宫来观察小鼠的行为学，通过海马组织及皮肤组织切片来研究细胞形态，同时检测抗氧化酶（如SOD，CAT）的活性，非酶抗氧化剂（T-AOC，GSH等）的水平及脂质过氧化产物(MDA)的生成量。结果显示，柿子单宁能部分改善由D-半乳糖引起的意识损伤，防止海马组织损伤，提高抗氧化能力，可能成为治疗衰老相关疾病的一种新的手段。
　　 5.柿子单宁在体外对LDL氧化的保护作用。
　　 在LDL的氧化修饰体系中加入柿子单宁后，可以显著延缓共轭二烯的形成、维持LDL的构象稳定、抑制脂质过氧化产物的生成等。因此，柿子单宁在体外对LDL的氧化修饰具有很好的保护作用。
　　 6.柿子单宁的结构分析。
　　 对柿子单宁的结构研究表明，柿子单宁有着不同于其它水果单宁的独特结构特点：①末端构成：Catechin(C)，epigallocatechin-3-O-gallate(EGCG)及杨梅素(myricetin)，延伸端结构为epicatechin(EC)，epigallocatechin(EGC)，EGCG，epicatechin-3-O-gallate(ECG)，较其它来源的缩合单宁具有更大的异质性，特别是含有一罕见的杨梅素末端；②柿子单宁原翠雀定(prodelphinidin)结构含量高达65%，其酰基化程度达72%;③除含B-型连接外还含有A-型连接。