谷蠹不同地理种群对磷化氢抗性及其遗传分化

摘要

谷蠹分布于世界各地，以热带和亚热带地区发生最重，幼虫和成虫均可在粮粒内为害，是我国主要的储粮害虫之一。目前，控制储粮害虫为害的主要熏蒸剂为磷化氢。由于仓库较差的密封性及多次重复无效熏蒸造成的选择性压力是造成储粮害虫对磷化氢产生抗性的重要原因。本研究主要针对中国储粮区内谷蠹不同地理种群对磷化氢的抗性进行了详细的调查，并对不同抗性的谷蠹种群瞬时增长率(ri)进行了探讨。利用AFLP及mtCOI基因进行了谷蠹种群的遗传变异研究，并讨论了谷蠹体内三种保护酶在磷化氢熏蒸前后的变化。具体研究结果如下：
　　 1.谷蠹不同地理种群对磷化氢的抗性
　　 采用FAO推荐的磷化氢抗性测定方法，测定了全国10个省及1个直辖市的16个谷蠹种群的抗性。试验种群的致死中浓度LC50范围为0.017 mg/L-4.272 mg/L，16个谷蠹种群均对磷化氢产生了不同程度的抗药性，其中，低抗性种群5个，中等抗性6个，高抗性种群5个。对谷蠹不同地理种群的磷化氢抗性水平研究表明，谷蠹对磷化氢的抗性在中国已经成为一个严重的问题。对谷蠹不同抗性种群的瞬时增长率研究表明，较高抗性的种群具有较低的瞬时增长率。把16个种群按照抗性系数大小进行排序，采集自粮食加工企业的种群聚在最顶端，接着是来自国家粮食储备库的种群，后面就是来自地方粮库的种群，采集自这三种粮库类型的谷蠹种群的平均RF值分别为5.465，61.490和277.643，这个结果说明，谷蠹种群的抗性跟仓库类型有关。
　　 2.谷蠹不同地理种群的遗传变异AFLP分析
　　 采用扩增片段长度多态性技术对这16个种群的110个个体进行种群遗传变异分析，结果表明：采用4对选择性扩增引物，在50-450 bp范围内共得到129个多态性位点，在种群水平上和种的水平上的多态性位点的百分率分别为43.95%和84.87%。Nei's遗传多样性指数(h)和Shannon's指数(I)与多态性比例具有一致性。这三个指数表明，谷蠹种群内存在高的遗传变异。
　　 分子变异分析(AMOVA)结果表明，16个谷蠹种群的遗传结构存在显著性差异(P<0.0005)。在整个变异中，17.62%的变异发生在谷蠹种群间，82.38%的变异发生在种群内部的个体之间。这个结果说明谷蠹的遗传变异主要发生在种群内部，而不是种群之间。整个谷蠹种群的φST值为0.176，基因流(Nm)为1.170。基因流大于1表明在谷蠹种群之间还是有一定的基因交流，这在一定程度上防止了由于遗传漂变引起的种群间的遗传分化。
　　 UPGMA聚类分析表明，谷蠹种群的遗传变异与种群的地理位置不相关。Mantel检测同样证明，谷蠹两两之间的Nei's遗传距离和地理距离(Lg值)之间没有显著的相关性(r=0.1054，P=0.8034>0.05)，这也表明IBD(isolation by distance)并不能用于描述谷蠹种群的遗传变异与地理距离之间的关系。对谷蠹种群分布的仓库类型及储粮生态区对种群的遗传变异分析结果表明，仓库类型及储粮生态区并不是影响种群变异的显著因子。
　　 3.谷蠹mtDNA-COI基因序列及种群遗传变异分析
　　 对15个种群的100个个体进行mtCOI部分序列分析，得到691bp长度的片段，三个位点的密码子中，A+T的含量平均值为63.2%，在三个密码子中的含量分别是85.2%，53.3%和57.0%。这种A+T含量的偏向在第一位点较第二和第三位点强。序列中A，T，C，G的含量分别为33.2%，32%，18.7%，16.2%。691bp长度的碱基中，共发现26个多态位点，定义了25种单倍型，其中种群间共享单倍型有7个。15个谷蠹种群之间存在一定的基因流(Nm=1.35)，但是使用AMOVA分析种群的遗传结构表明，谷蠹种群的变异主要发生在种群内部的个体间。
　　 4.磷化氢对不同地理种群谷蠹成虫体内三种保护酶的影响
　　 对不同地理种群谷蠹成虫体内过氧化氢酶(CAT)，超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化物酶(POD)的活性研究表明：熏蒸前，不同地理种群的谷蠹成虫体内三种保护酶的活性不同；使用磷化氢进行熏蒸处理后，不同地理种群谷蠹体内的三种保护酶活性的变化规律为：SOD活力升高，POD和CAT活性降低。采用SPSS16.0分别对熏蒸前试验种群的致死中浓度(LC50)及三种酶活性两两变量进行相关性分析，结果表明：试验种群的LC50与CAT之间存在显著简单相关性(P=0.031<0.05)；LC50与SOD，POD两种酶活性不存在显著相关性(P=0.545；0.053>0.05)；CAT及POD之间存在简单相关性(P=0.034<0.05)。

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献综述

1 谷蠹概述

1.1 分布及危害

1.2 形态特征及生活习性

1.3 谷蠢的防治

2 储粮害虫的抗药性

2.1 储粮害虫抗性

3 储粮害虫对磷化氢产生抗性的原因

4 储粮害虫抗性机理研究

5 储粮害虫对磷化氢抗性机理研究

6 mtCOI研究现状

7 AFLP研究现状

7.1 AFLP技术的基本原理

7.2 AFLP技术的特点

7.3 AFLP技术在昆虫系统学研究中的应用

8 本研究的意义

9 本研究拟解决的问题及创新点

第二章 谷蠹不同地理种群磷化氢的抗性

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 实验方法

1.3 数据统计

2 结果与分析

2.1 磷化氢的标准曲线

2.2 磷化氢对16个谷蠹种群的相对毒力

2.3 种群的瞬时增加率(r1)

3 讨论

第三章 AFLP技术对谷蠹不同地理种群的遗传多样性研究

1 材料和方法

1.1 供试昆虫

1.2 试剂与仪器

1.3 DNA提取

1.4 酶切与连接

1.5 预扩增与选择性扩增

1.6 电泳及银染

1.7 数据分析

2 结果与分析

2.1 DNA的检测

2.2 AFLP实验结果

3 讨论

第四章 谷蠹mtCOI基因序列及种群遗传变异分析

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 DNA提取

1.3 PCR扩增

1.4 PCR产物的连接转化

1.5 mtCOI测序分析

2 结果与分析

2.1 DNA检测

2.2 PCR产物检测

2.3 克隆子PCR检测

2.4 测序及分析

2.5 COI序列组成分析

2.6 COI碱基替换颠换分析

2.7 COI密码子的使用和氨基酸的组成

2.8 单倍型分布及其碱基差异

2.9 遗传距离分析

2.10 谷蠹种群的遗传多样性及基因流

3.讨论

第五章 磷化氢对谷蠹不同抗性种群体内三种保护酶的影响

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 测定方法

1.3 数据分析

2 结果与分析

2.1 不同谷蠹地理种群的磷化氢抗性分析

2.2 三种酶活性的单因变量多因素方差分析

2.3 不同地理种群谷蠹体内过氧化氢酶(CAT)活性测定

2.4 不同地理种群谷蠹体内超氧化物歧化酶(SOD)活性测定

2.5 不同地理种群谷蠹体内过氧化物酶(POD)活性测定

2.6 谷蠹对磷化氢的抗性与三种酶活性相关性分析

2.7 磷化氢抗性系数与CAT比活力之间的相关性分析

3 讨论

第六章 全文总结与展望

1 全文总结

2 主要创新点

3 研究展望

参考文献

附录1

附录2

附录3

致谢