拟南芥小G蛋白RabD2b的表达、定位及功能研究

摘要

Rab是小G蛋白超家族中最大的一个家族，它们广泛存在于动物、植物及微生物中，在囊泡运输的不同阶段发挥其调控作用。Rab1类小G蛋白是Rab蛋白家族的一个亚家族，酵母和哺乳动物的Rab1类蛋白(Ypt1和Rab1)调控从内质网到高尔基体的囊泡运输过程。植物中Rab1类小G蛋白归属于RabD亚家族。拟南芥RabD亚家族又被分为功能不同的两个亚类AtRabD1(包括一个成员AtRabD1)和AtRabD2(包括三个成员AtRabD2a、AtRabD2b和AtRabD2c)。目前，AtRabD1和AtRabD2a的功能研究开展较多，它们的功能类似于Ypt1和Rab1，调控内质网到高尔基体的囊泡运输过程。
　　但另外两个成员AtRabD2b和AtRabD2c的细胞学和生理学功能还不清楚。本研究中，我们分析了AtRabD2b的表达谱和亚细胞定位，同时，利用基因敲除突变体和转基因植株对AtRabD基因的生理功能进行了研究。主要研究结果如下：
　　 (1)不同物种(拟南芥，酵母以及哺乳动物)Rab1类小G蛋白的氨基酸序列高度保守，而且它们都具有保守的功能结构域(核苷酸结合结构域和效应因子结合结构域)；AtRabD2b能够互补酵母温敏突变体ASY01(ypt1)的缺陷表型，表明AtRabD2b与Ypt1是功能上相似的同源蛋白；
　　 (2)烟草叶片表皮细胞瞬时转化结果表明AtRabD2b主要定位在细胞内的高尔基体上。通过定点诱变的方法获得了AtRabD2b的两种突变形式：组成性结合GTP的活性形式AtRabD2b[Q67L]和无核苷酸结合的非活性形式AtRabD2b[N121I]。AtRabD2b[Q67L]主要定位在高尔基体上，而AtRabD2b[N121I]则弥散在细胞质中，表明不同的核苷酸结合状态会影响AtRabD2b的亚细胞定位；
　　 (3)RT-PCR结果显示AtRabD2b基因在植株的根、茎、叶、花、角果等组织中都有表达，表明它是组成型表达的蛋白。GUS组织染色结果显示AtRabD2b在幼苗和成熟期的不同组织中都有表达，但是在幼嫩以及生长发育比较旺盛的部位中优先表达；
　　 (4)atrabd2b单突变体和atrabd2b/atrabd2c双突变体没有出现异于野生型植株的表型。YFP-AtRabD2b[Q67L]的超表达植株出现矮化、莲座叶宽度增加以及果柄与花序轴夹角减少等异常表型。超表达YFP-AtRabD2b[Q67L]还导致了AtRabD2b基因的共抑制，产生了AtRabD2b，AtRabD2c和AtRabD1基因下调表达的转基因植株，这些转基因植株的茎顶端部分由绿变紫，并逐渐坏死，成熟期植株表现出矮化、丛生、不育等表型。这些结果表明AtRabD基因参与了植物的多个生长发育过程，而且AtRabD亚家族蛋白间存在着高度的功能冗余。
　　 (5)显微切片结果表明，AtRabD2b基因共抑制植株茎段的坏死起始于细胞的死亡，坏死细胞首先在外围的表皮细胞层中发现，然后沿着切面在细胞和细胞之间蔓延。透射电镜观察结果表明在即将死亡的细胞中，叶绿体发育异常，内囊体片层膜数目减少，并且这些细胞中的细胞器被液泡逐渐吞噬。这些结果暗示了AtRabD基因在体内调控的囊泡运输过程对于维持植物某些组织的细胞活性有重要的作用。
　　 (6)AtRabD2b蛋白C末端两个保守的半胱氨酸残基是蛋白质进行异戊二烯化修饰的重要位点。PCR扩增获得了AtRabD2b单个半胱氨酸突变或两个半胱氨酸缺失的序列AtRabD2bC199S和AtRabD2b△CC。亚细胞定位结果显示两个突变蛋白都定位在细胞质中；酵母互补实验表明两个突变基因不能互补ypt1温敏突变体，而且AtRabD2bC199S和AtRabD2b△CC超表达拟南芥植株表现出与AtRabD2b超表达植株不同的表型。这些结果表明保守半胱氨酸的突变造成了AtRabD2b亚细胞定位和功能的改变。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表(Abbreviation)

第一章 前言

1 研究背景

2 文献综述

2.1 非生物逆境和生物逆境

2.2 非生物逆境对植物的伤害

2.3 植物对非生物逆境的适应

2.4 植物对逆境胁迫的应答

2.5 ABF与植物抗旱的关系

2.6 MAPK与植物抗旱的关系

2.7 bHLH与植物抗寒的关系

2.8 ICE1与植物抗寒的关系

第二章 枳PtrABF基因的分离、克隆及功能研究

1 引言

2 材料和方法

2.1 植物材料和逆境处理

2.2 PtrABF基因克隆及表达分析

2.3 基因表达分析(Real-time-PCR)

2.4 PtrABF基因亚细胞定位

2.5 PtrABF转录激活及转录结合分析

2.6 植物转化载体构建

2.7 烟草的遗传转化

2.8 转化植株的分子及生理鉴定

2.9 电导率及叶绿素测定

2.10 过氧化氢(H2O2)和超氧阴离子(O2-)的测定

2.11 抗氧化酶活力的测定

2.12 统计分析

3 结果与分析

3.1 PtrABF的克隆及生物信息学分析

3.2 PtrABF对非生物逆境的响应模式

3.3 PtrABF亚细胞定位

3.4 PtrABF转录激活及与ABRE转录结合分析

3.5 PtrABF能够增强植物抗脱水及抗干旱能力

3.6 转基因植株和未转化植株活性氧检测

3.7 转基因烟草及野生型干旱前后抗氧化酶活性及编码基因表达分析

3.8 干旱前后逆境相关基因的表达分析

4 讨论

第三章 枳PtrMAPK基因的分离、克隆及功能鉴定

1 引言

2 材料和方法

2.1 植物材料及逆境处理

2.2 PtrMAPK的克隆及生物信息学分析

2.3 PtrMAPK的亚细胞定位

2.4 蛋白激酶的活性分析

2.5 植物转化载体构建

2.6 烟草的遗传转化

2.7 阳性转基因烟草初步确定

2.8 转化植株的分子及生理鉴定

2.9 转基因烟草和野生型烟草的抗性分析

2.10 电导率、叶绿素含量、超氧阴离子(O2-)、过氧化氢(H2O2)、丙二醛含量、抗氧化酶活性及代谢水平的分析

2.11 细胞死亡及相对含水量的测定

2.12 实时定量进行表达分析

3 结果

3.1 PtrMAPK全长cDNA克隆及序列分析

3.2 PtrMAPK逆境下的表达模式

3.3 PtrMAPK亚细胞定位

3.4 PtrMAPK蛋白激酶活性分析

3.5 PtrMAPK烟草的遗传转化及再生

3.6 PtrMAPK转基因烟草抗性鉴定

3.7 相对含水量及细胞死亡测定

3.8 组织化学染色分析H2O2和O2-积累

3.9 抗氧化酶活性及代谢物含量分析

3.10 SOD及POD抑制剂能减弱转基因系的抗性

3.11 活性氧及逆境相关基因在WT及转基因系干旱处理前后的表达分析

4 讨论

第四章 枳PtrbHLH基因的分离、克隆及功能鉴定

1 引言

2 材料和方法

2.1 植物材料和逆境处理

2.2 PtrbHLH基因克隆及生物信息学分析

2.3 定量分析基因的表达模式

2.4 PtrbHLH基因亚细胞定位、转录激活及转录结合分析

2.5 植物转化超表达载体构建

2.6 烟草的遗传转化

2.7 RNAi-PtrbHLH抑制表达载体构建

2.8 柠檬遗传转化

2.9 转化植株分子及生理鉴定

2.10 半定量PCR检测PtrbHLH基因的超表达

2.11 电导率及脯胺酸测定

2.12 细胞死亡染色

2.13 统计分析

2.14 POD抑制剂(叠氮化钠，NaN3)处理

2.15 芯片杂交及数据分析

2.16 芯片中差异基因功能注释

2.17 Real-time-PCR验证芯片结果

3 结果与分析

3.1 PtrbHLH克隆及生物信息学分析

3.2 PtrbHLH各种不同逆境下的响应模式

3.3 PtrbHLH亚细胞定位

3.4 PtrbHLH转录激活及转录结合分析

3.5 PtrbHLH转基因烟草超表达分析

3.6 PtrbHLH转基因烟草的超表达能够增强其抗寒能力

3.7 PtrbHLH转基因柠檬的转化及抗性分析

3.8 基因芯片挑选的差异基因

3.9 差异基因功能注释和分类

3.10 差异基因中上调的氧化酶

3.11 挑选的候选基因在处理前后的表达

3.12 PtrbHLH调节转基因柠檬的ROS清除能力

3.13 PtrbHLH调节转基因烟草的ROS清除能力

3.14 PtrbHLH同E-box的转录结合分析

4 讨论

5 结论

第五章 枳PtrICE基因的分离、克隆及功能研究

1 引言

2 材料和方法

2.1 PtrICE1的克隆和生物信息学分析

2.2 定量分析基因的表达模式

2.3 PtrICE1基因亚细胞定位和转录激活分析

2.4 PtrICE转录激活及与MYC的转录结合

2.5 植物转化载体构建

2.6 转基因烟草的抗性分析

2.7 枳cDNA文库的构建

2.8 RNAi-PtrICE1抑制表达载体构建

3 结论

3.1 PtrICE1的克隆及生物信息学分析

3.2 PtrICE1在不同逆境下的时空表达模式

3.3 PtrICE1亚细胞定位

3.4 PtrICE1的转录激活活性分析

3.5 PtrICE1酵母双杂文库构建

3.6 PtrICE1转基因烟草的转化过程及获得

3.7 PtrICE1转基因烟草和PCR鉴定及超表达分析

3.8 PtrICE1的超表达增强植物抗寒能力

3.9 PtrICE1抑制表达转基因植株表型分析

4 讨论

5 结论

参考文献

附表 IC8/WT基因芯片杂交数据

附录I

致谢